После создания кокультуры стромальных эндотелиальных клеток получите сигнал GFP от GFP huvec с помощью флуоресцентной микроскопии с настройками, подходящими для количественного определения. Выполните предварительную обработку всех изображений, полученных в один и тот же день, чтобы еще больше усилить контраст. Если вы используете fiji или изображение J, откройте все изображения расширенного канала GFP в одну и ту же точку времени и откройте меню яркости и контрастности.
Выберите изображение, представляющее промежуточное состояние, и автоматически настройте контрастность, выбрав авто. Нажмите кнопку Установить и установите флажок Распространить на все остальные открытые изображения. Визуально оцените, подходит ли автоматически выбранный диапазон ко всем изображениям текущей временной точки.
При необходимости вручную измените и распространите диапазон на все изображения и сохраните скорректированные изображения в виде файлов TIFF. Далее, примените фильтр медианного размытия ко всем изображениям. Уменьшите размер путем группирования и сохраните их как файлы RGB цвета TIFF в оттенках серого в папке для количественной оценки.
Это можно сделать вручную или в пакетном режиме с помощью макросов. Проанализируйте все созданные изображения в режиме пакетного процесса в анализаторе ангиогенеза для изображения J. Затем проверьте результаты количественной оценки, изучив наложения распознанных структур и исходных изображений. Настройте параметры предварительной обработки, повторно проанализируйте исходные изображения или исключите проблемные области, если алгоритм обнаруживает искусственные структуры с небольшим количеством клеток или без них, видимых на исходном изображении.
Наконец, нормализуем полученные значения до площади в один квадратный миллиметр, умножив значения каждой выборки на отношение анализируемой площади к одному квадратному миллиметру. Количественные параметры сетей GFP huvec показали, что общая длина сети была наибольшей при наличии FGF-2 и наименьшей при отсутствии факторов роста. Количество соединений, указывающих на точки разветвления в сетях, следовало той же тенденции, что и общая длина.
И наоборот, оба фактора роста показали значительно меньшее количество изолированных сегментов, что указывает на более высокую взаимосвязанность, чем при условии без какого-либо фактора роста.
