Después de establecer el cocultivo de células endoteliales estromales, adquirir la señal GFP del HUVEC GFP utilizando microscopía de fluorescencia con ajustes adecuados para la cuantificación. Preprocese todas las imágenes adquiridas el mismo día para mejorar aún más el contraste. Si utiliza fiji o la imagen J, abra todas las imágenes mejoradas del canal GFP en el mismo punto de tiempo y abra el menú de brillo y contraste.
Seleccione una imagen que represente una condición intermedia y ajuste automáticamente el contraste seleccionando automático. Haga clic en establecer y marque propagar a todas las demás imágenes abiertas. Evalúe visualmente si el rango seleccionado automáticamente se ajusta a todas las imágenes del punto de tiempo actual.
Si es necesario, reajuste y vuelva a propagar manualmente el rango a todas las imágenes y guarde las imágenes ajustadas como archivos TIFF. A continuación, aplique un filtro de desenfoque mediano a todas las imágenes. Reduzca el tamaño agrupándolos y guárdelos como archivos TIFF de color RGB en escala de grises en una carpeta para su cuantificación.
Esto se puede hacer manualmente o en modo por lotes usando macros. Analice todas las imágenes creadas utilizando el modo de proceso por lotes en el analizador de angiogénesis para la imagen J.A continuación, valide los resultados de cuantificación examinando las superposiciones de las estructuras reconocidas y las imágenes originales. Ajuste los parámetros de preprocesamiento, vuelva a analizar las imágenes originales o excluya áreas problemáticas si el algoritmo detecta estructuras artificiales con pocas o ninguna celda visible en la imagen original.
Finalmente normalizar los valores obtenidos a un área de un milímetro cuadrado multiplicando los valores de cada muestra por la relación del área analizada a un milímetro cuadrado. Los parámetros cuantificados de las redes huvec GFP mostraron que la longitud total de la red era más alta en presencia de FGF-2 y más baja en ausencia de factores de crecimiento. El número de uniones que indican puntos de ramificación en las redes siguió la misma tendencia que la longitud total.
Por el contrario, ambos factores de crecimiento presentaron significativamente menos segmentos aislados que indican una mayor interconectividad que la condición sin ningún factor de crecimiento.
