Efter etablering av samodling av stromala endotelceller, erhålla GFP-signalen från GFP-huvec med hjälp av fluorescensmikroskopi med inställningar som är lämpliga för kvantifiering. Förbehandla alla bilder som förvärvats samma dag för att ytterligare förbättra kontrasten. Om du använder fiji eller bild J öppnar du alla förbättrade GFP-kanalbilder samtidigt och öppnar menyn för ljusstyrka och kontrast.
Välj en bild som representerar ett mellanliggande villkor och justera kontrasten automatiskt genom att välja auto. Klicka på set och markera sprida till alla andra öppna bilder. Utvärdera visuellt om det automatiskt valda intervallet passar alla bilder i den aktuella tidpunkten.
Om det behövs justerar och sprider du intervallet manuellt till alla bilder och sparar de justerade bilderna som TIFF-filer. Använd sedan ett mediansuddighetsfilter på alla bilder. Minska storleken genom att gruppera och spara dem som RGB-färg-TIFF-filer i gråskala i en mapp för kvantifiering.
Detta kan göras manuellt eller i batchläge med makron. Analysera alla skapade bilder med batchprocessläget i angiogenesanalysatorn för bild J.Validera sedan kvantifieringsresultaten genom att undersöka överlagringarna av de igenkända strukturerna och originalbilderna. Justera förbehandlingsparametrar, analysera originalbilder igen eller uteslut problematiska områden om algoritmen upptäcker konstgjorda strukturer med få eller inga celler synliga i originalbilden.
Slutligen normalisera de erhållna värdena till ett område av en kvadratmillimeter genom att multiplicera värdena för varje prov med förhållandet mellan det analyserade området och en kvadratmillimeter. Kvantifierade parametrar för GFP-huvec-näten visade att den totala nätverkslängden var högst i närvaro av FGF-2 och lägst i frånvaro av tillväxtfaktorer. Antalet knutpunkter som anger förgreningspunkter i näten följde samma trend som den totala längden.
Omvänt innehöll båda tillväxtfaktorerna betydligt färre isolerade segment som indikerar högre sammankoppling än tillståndet utan någon tillväxtfaktor.
