للبدء ، خذ الثقافة المشتركة hBM-MSCs و GFP-HUVECs واغسلها مرة واحدة باستخدام 200 ميكرولتر لكل بئر من PBS. أضف محلول الركيزة BCIP / NBT واحتضان الثقافات عند 37 درجة مئوية مع مراقبة تطور اللون بشكل دوري. بمجرد تطور اللون في ظروف غير عظمية ، يتم غسلها على الفور ب 200 ميكرولتر لكل بئر من PBS.
بعد تثبيت العينات في 4٪ بارافورمالدهيد ، احصل على صور ملونة للعينات الملطخة. لتحديد نشاط ALP في الخلايا المحللة ، أضف 200 ميكرولتر لكل بئر من 0.25٪ Trypsin-EDTA إلى الثقافات المغسولة باستخدام PBS واحتضانها عند 37 درجة مئوية. قم بتحريك الثقافات كل 10 دقائق عن طريق السحب بقوة لأعلى ولأسفل لتسهيل عملية الهضم ومراقبة مورفولوجيا الثقافة باستخدام مجهر زراعة الخلايا القياسي.
ثم انقل العينات إلى أنابيب سعة 2 ملليلتر وأضف 200 ميكرولتر من الوسط القاعدي للخلايا الجذعية الوسيطة لتثبيط التربسين. بعد الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية, قم بتجميد الكريات عند 80 درجة مئوية أو انتقل مباشرة إلى الخطوة التالية. قم بإذابة كريات الخلية ، وأضف 500 ميكرولتر من محلول التحلل ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة على الجليد.
جهاز الطرد المركزي التالي عند 16 ، 100 G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية والاحتفاظ بالعينات على الجليد. دون إزعاج أي حطام حبيبي ، قم بتوزيع 50 ميكرولترا من المادة الطافية في كل بئر من لوحة 96 بئرا لزراعة الأنسجة الشفافة في نسخ. أضف 50 ميكرولترا من كاشف الفوسفاتيز القلوي المحضر إلى آبار صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 96 بئرا.
هز اللوحة لفترة وجيزة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق محمية من الضوء. أوقف التفاعل بإضافة 100 ميكرولتر من 1-مولار هيدروكسيد الصوديوم باستخدام ماصة متعددة القنوات. باستخدام قارئ الألواح ، اقرأ الكثافة البصرية عند 410 نانومتر.
لتحديد كمية الحمض النووي ، قم بإذابة العينات المجمدة ، وطردها مركزيا ، وضعها على الجليد. دون إزعاج أي حطام حبيبي ، قم بتوزيع 50 ميكرولترا من طافي الخلية المحللة في آبار صفيحة سوداء مكونة من 96 بئرا في نسخ. أضف معايير الحمض النووي في نسخ مكررة.
بعد ذلك ، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 50 ميكرولترا من عامل تلطيخ الحمض النووي ، ثم احتضان وقراءة شدة التألق وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدم قيم المنحنى القياسية لتحديد وتطبيق تحويل قيم الشدة المقاسة إلى تركيزات الحمض النووي. أخيرا ، قم بتطبيع قيم الفوسفاتيز القلوية بتقسيمها على تركيز الحمض النووي لكل عينة.
أظهر القياس الكمي لنشاط الفوسفاتيز القلوي لتوصيف الإمكانات العظمية للمزارع أن نشاط الفوسفاتيز القلوي الطبيعي يختلف اختلافا كبيرا عبر الظروف مع اتجاه لزيادة النشاط بتركيزات أعلى من BMP-2 وهضبة عند 100 نانوجرام لكل ملليلتر. تم تحديد أدنى مستويات النشاط للحالة التي تحتوي على 50 نانوجرام لكل مليلتر FGF-2. لوحظ تلطيخ أرجواني أكثر شمولا وكثافة في وجود BMP-2 مقارنة ب FGF-2.
