Til at begynde med skal du tage hBM-MSC'erne og GFP-HUVECs co-kultur og vaske en gang med 200 mikroliter pr. PBS-brønd. Tilsæt BCIP/NBT-substratopløsningen, og inkuber kulturerne ved 37 grader Celsius, mens farveudviklingen overvåges med jævne mellemrum. Når farven udvikler sig under ikke-osteogene forhold, vaskes straks med 200 mikroliter pr. PBS-brønd.
Efter fastgørelse af prøverne i 4% paraformaldehyd erhverves farvebilleder af de farvede prøver. For at kvantificere ALP-aktiviteten i cellelysater tilsættes 200 mikroliter pr. Brønd på 0,25% Trypsin-EDTA til kulturerne vasket med PBS og inkuberes ved 37 grader Celsius. Omrør kulturerne hvert 10. minut ved kraftigt at pipettere op og ned for at lette fordøjelsen og overvåge kulturmorfologien med et standard cellekulturmikroskop.
Overfør derefter prøverne til 2 ml rør og tilsæt 200 mikroliter mesenkymal stamcelle basalmedium for at hæmme trypsin. Efter centrering og kassering af supernatanten fryses pellets ved 80 grader Celsius eller fortsættes direkte til næste trin. Optø cellepillerne, tilsæt 500 mikroliter lysisbuffer og inkuber i 30 minutter på is.
Derefter centrifugeres ved 16, 100 G i 10 minutter ved fire grader Celsius og opbevares prøverne på is. Uden at forstyrre pelleteret affald hældes 50 mikroliter supernatant i hvert hul i en gennemsigtig 96-brønds plade i en gennemsigtig vævskultur i to eksemplarer. Tilsæt 50 mikroliter af det fremstillede alkaliske fosfatasereagens til brøndene på 96-brønds vævskulturpladen.
Ryst pladen kort og inkuber den ved 37 grader Celsius i 10 minutter beskyttet mod lys. Stop reaktionen ved at tilsætte 100 mikroliter 1-molært natriumhydroxid ved hjælp af en flerkanalspipette. Brug en pladelæser til at læse den optiske tæthed ved 410 nanometer.
Til DNA-kvantificering optø de frosne prøver, centrifuger dem og læg dem på is. Uden at forstyrre pelleteret affald hældes 50 mikroliter cellelysatsupernatant i hullerne på en sort plade med 96 brønde i to eksemplarer. Tilføj DNA-standarderne i dubletter.
Brug derefter en flerkanalpipette til at tilsætte 50 mikroliter DNA-farvningsmiddel, inkuber derefter og læs fluorescensintensiteten i henhold til producentens anvisninger. Brug standardkurveværdierne til at bestemme og anvende konverteringen af de målte intensitetsværdier til DNA-koncentrationerne. Endelig normaliseres de alkaliske fosfataseværdier ved at dividere dem med den respektive DNA-koncentration af hver prøve.
Kvantificering af alkalisk fosfataseaktivitet for at karakterisere kulturernes osteogene potentiale viste, at den normaliserede alkaliske fosfataseaktivitet varierede meget på tværs af forholdene med en tendens til stigende aktivitet med højere koncentrationer af BMP-2 og et plateau ved 100 nanogram pr. milliliter. De laveste aktivitetsniveauer blev identificeret for tilstanden indeholdende 50 nanogram pr. milliliter FGF-2. Mere omfattende og intens lilla farvning blev observeret i nærvær af BMP-2 sammenlignet med FGF-2.
