Neem om te beginnen de hBM-MSCs en GFP-HUVECs co-cultuur en was eenmaal met 200 microliter per put PBS. Voeg de BCIP/NBT-substraatoplossing toe en inccubeer de culturen bij 37 graden Celsius terwijl u periodiek de kleurontwikkeling controleert. Zodra de kleur zich ontwikkelt in niet-osteogene omstandigheden, onmiddellijk gewassen met 200 microliter per put van PBS.
Nadat u de monsters in 4% paraformaldehyde hebt gefixeerd, verkrijgt u kleurenafbeeldingen van de gekleurde monsters. Om de ALP-activiteit in cellysaten te kwantificeren, voegt u 200 microliter per put van 0,25% Trypsine-EDTA toe aan de culturen gewassen met PBS en incubeert u bij 37 graden Celsius. Roer de culturen elke 10 minuten door krachtig op en neer te pipetten om de spijsvertering te vergemakkelijken en de kweekmorfologie te controleren met een standaard celkweekmicroscoop.
Breng vervolgens de monsters over naar buisjes van 2 milliliter en voeg 200 microliter mesenchymaal basaal stamcelmedium toe om de trypsine te remmen. Na het centrifugeren en weggooien van het supernatant, vries de pellets in bij 80 graden Celsius of ga direct door naar de volgende stap. Ontdooi de celkorrels, voeg 500 microliter lysisbuffer toe en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
Centrifugeer vervolgens op 16, 100 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en bewaar de monsters op ijs. Zonder gepelletiseerd puin te verstoren, doseer 50 microliter van het supernatant in elke put van een transparante weefselkweekplaat met 96 putten in duplicaten. Voeg 50 microliter van het bereide alkalische fosfatase-reagens toe aan de putjes van de 96-well weefselkweekplaat.
Schud de plaat kort en incubeer hem op 37 graden Celsius gedurende 10 minuten beschermd tegen licht. Stop de reactie door 100 microliter 1-molair natriumhydroxide toe te voegen met behulp van een meerkanaals pipet. Lees met behulp van een plaatlezer de optische dichtheid af op 410 nanometer.
Voor DNA-kwantificering ontdooi je de bevroren monsters, centrifugeer je ze en plaats je ze op ijs. Zonder gepelletiseerd puin te verstoren, doseer 50 microliter van het cellysaatsupernatant in de putten van een zwarte 96-putplaat in duplicaten. Voeg de DNA-standaarden in duplicaten toe.
Gebruik vervolgens een meerkanaalspipet om 50 microliter van het DNA-kleuringsmiddel toe te voegen, incuber en lees vervolgens de fluorescentie-intensiteit volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik de standaardcurvewaarden om de conversie van de gemeten intensiteitswaarden naar de DNA-concentraties te bepalen en toe te passen. Normaliseer ten slotte de alkalische fosfatasewaarden door ze te delen door de respectieve DNA-concentratie van elk monster.
Kwantificering van alkalische fosfatase-activiteit om het osteogene potentieel van de culturen te karakteriseren, toonde aan dat de genormaliseerde alkalische fosfatase-activiteit sterk varieerde tussen omstandigheden met een trend van toenemende activiteit met hogere concentraties BMP-2 en een plateau bij 100 nanogram per milliliter. De laagste activiteitsniveaus werden geïdentificeerd voor de aandoening met 50 nanogram per milliliter FGF-2. Meer uitgebreide en intense paarse kleuring werd waargenomen in de aanwezigheid van BMP-2 in vergelijking met FGF-2.
