Pour commencer, prenez la co-culture hBM-MSCs et GFP-HUVECs et lavez une fois avec 200 microlitres par puits de PBS. Ajouter la solution de substrat BCIP/NBT et incuber les cultures à 37 degrés Celsius tout en surveillant périodiquement le développement de la couleur. Une fois que la couleur se développe dans des conditions non ostéogéniques, immédiatement lavée avec 200 microlitres par puits de PBS.
Après avoir fixé les échantillons dans du paraformaldéhyde à 4%, acquérir des images en couleur des échantillons colorés. Pour quantifier l’activité ALP dans les lysats cellulaires, ajoutez 200 microlitres par puits de trypsine-EDTA à 0,25% aux cultures lavées avec du PBS et incuber à 37 degrés Celsius. Agiter les cultures toutes les 10 minutes en pipetant vigoureusement de haut en bas pour faciliter la digestion et surveiller la morphologie de la culture avec un microscope de culture cellulaire standard.
Ensuite, transférez les échantillons dans des tubes de 2 millilitres et ajoutez 200 microlitres de milieu basal de cellules souches mésenchymateuses pour inhiber la trypsine. Après avoir centriflé et jeté le surnageant, congelez les pastilles à 80 degrés Celsius ou passez directement à l’étape suivante. Décongeler les pastilles cellulaires, ajouter 500 microlitres de tampon de lyse et incuber pendant 30 minutes sur de la glace.
Ensuite, centrifuger à 16, 100 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et garder les échantillons sur la glace. Sans déranger les débris granulés, distribuer 50 microlitres du surnageant dans chaque puits d’une plaque transparente de culture tissulaire de 96 puits en doubles. Ajouter 50 microlitres du réactif phosphatase alcaline préparé aux puits de la plaque de culture tissulaire à 96 puits.
Secouez brièvement l’assiette et incuberez-la à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes à l’abri de la lumière. Arrêtez la réaction en ajoutant 100 microlitres d’hydroxyde de sodium 1-molaire à l’aide d’une pipette multicanal. À l’aide d’un lecteur de plaques, lisez la densité optique à 410 nanomètres.
Pour la quantification de l’ADN, décongelez les échantillons congelés, centrifugez-les et placez-les sur de la glace. Sans déranger les débris granulés, distribuer 50 microlitres du surnageant de lysat cellulaire dans les puits d’une plaque noire de 96 puits en doubles. Ajoutez les normes d’ADN en double.
Ensuite, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 50 microlitres de l’agent de coloration de l’ADN, puis incuber et lire l’intensité de fluorescence selon les instructions du fabricant. Utiliser les valeurs standard de la courbe pour déterminer et appliquer la conversion des valeurs d’intensité mesurées aux concentrations d’ADN. Enfin, normalisez les valeurs de phosphatase alcaline en les divisant par la concentration d’ADN respective de chaque échantillon.
La quantification de l’activité de la phosphatase alcaline pour caractériser le potentiel ostéogénique des cultures a montré que l’activité normalisée de la phosphatase alcaline variait considérablement d’une affection à l’autre, avec une tendance à l’augmentation de l’activité avec des concentrations plus élevées de BMP-2 et un plateau à 100 nanogrammes par millilitre. Les niveaux d’activité les plus faibles ont été identifiés pour la condition contenant 50 nanogrammes par millilitre FGF-2. Une coloration pourpre plus étendue et plus intense a été observée en présence de BMP-2 par rapport au FGF-2.
