Nehmen Sie zunächst die hBM-MSCs und GFP-HUVECs Co-Kultur und waschen Sie sie einmal mit 200 Mikrolitern PBS pro Well. Fügen Sie die BCIP/NBT-Substratlösung hinzu und inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius, während Sie die Farbentwicklung regelmäßig überwachen. Sobald sich die Farbe unter nicht-osteogenen Bedingungen entwickelt hat, sofort mit 200 Mikrolitern PBS pro Well waschen.
Nachdem die Proben in 4%igem Paraformaldehyd fixiert wurden, werden Farbbilder der gefärbten Proben aufgenommen. Um die ALP-Aktivität in Zelllysaten zu quantifizieren, werden den mit PBS gewaschenen Kulturen 200 Mikroliter 0,25%Trypsin-EDTA pro Well zugesetzt und bei 37 Grad Celsius inkubiert. Rühren Sie die Kulturen alle 10 Minuten, indem Sie kräftig auf und ab pipettieren, um die Verdauung zu erleichtern, und überwachen Sie die Kulturmorphologie mit einem Standard-Zellkulturmikroskop.
Übertragen Sie dann die Proben in 2-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie 200 Mikroliter mesenchymales Stammzell-Basalmedium hinzu, um das Trypsin zu hemmen. Nachdem Sie den Überstand zentriert und entsorgt haben, frieren Sie die Pellets bei 80 Grad Celsius ein oder fahren Sie direkt mit dem nächsten Schritt fort. Tauen Sie die Zellpellets auf, fügen Sie 500 Mikroliter Lysepuffer hinzu und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang auf Eis.
Als nächstes zentrifugieren Sie bei 16, 100 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und halten Sie die Proben auf Eis. Geben Sie 50 Mikroliter des Überstandes in Duplikate in jede Vertiefung einer transparenten 96-Well-Platte für Gewebekulturen, ohne diese zu stören. Geben Sie 50 Mikroliter des hergestellten alkalischen Phosphatase-Reagenzes in die Vertiefungen der 96-Well-Gewebekulturplatte.
Den Teller kurz schütteln und bei 37 Grad Celsius 10 Minuten lichtgeschützt inkubieren. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 100 Mikroliter 1-molare Natronlauge mit einer Mehrkanalpipette hinzufügen. Lesen Sie mit einem Plattenleser die optische Dichte bei 410 Nanometern ab.
Tauen Sie die gefrorenen Proben zur DNA-Quantifizierung auf, zentrifugieren Sie sie und legen Sie sie auf Eis. Geben Sie 50 Mikroliter des Zelllysatüberstandes in Duplikate in die Vertiefungen einer schwarzen 96-Well-Platte, ohne die pelletierten Ablagerungen zu stören. Fügen Sie die DNA-Standards in Duplikaten hinzu.
Als nächstes verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 Mikroliter des DNA-Färbemittels hinzuzufügen, dann inkubieren und lesen Sie die Fluoreszenzintensität gemäß den Anweisungen des Herstellers ab. Verwenden Sie die Standardkurvenwerte, um die Umrechnung der gemessenen Intensitätswerte auf die DNA-Konzentrationen zu bestimmen und anzuwenden. Zum Schluss normalisieren Sie die Werte der alkalischen Phosphatase, indem Sie sie durch die jeweilige DNA-Konzentration jeder Probe dividieren.
Die Quantifizierung der alkalischen Phosphataseaktivität zur Charakterisierung des osteogenen Potenzials der Kulturen zeigte, dass die normalisierte alkalische Phosphataseaktivität unter verschiedenen Bedingungen stark variierte, mit einem Trend zu steigender Aktivität mit höheren Konzentrationen von BMP-2 und einem Plateau bei 100 Nanogramm pro Milliliter. Die niedrigsten Aktivitätswerte wurden für die Erkrankung mit 50 Nanogramm pro Milliliter FGF-2 ermittelt. In Gegenwart von BMP-2 wurde eine umfangreichere und intensivere violette Färbung im Vergleich zu FGF-2 beobachtet.
