כדי להתחיל, לקחת את hBM-MSCs ו GFP-HUVECs תרבות משותפת ולשטוף פעם אחת עם 200 מיקרוליטר לכל באר של PBS. הוסף את תמיסת מצע BCIP/NBT ודגר על התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך מעקב תקופתי אחר התפתחות הצבע. ברגע שהצבע מתפתח בתנאים שאינם אוסטאוגניים, נשטף מיד עם 200 מיקרוליטר לכל באר של PBS.
לאחר קיבוע הדגימות ב 4% paraformaldehyde, לרכוש תמונות צבע של הדגימות מוכתמות. כדי לכמת את פעילות ה-ALP בליזטים של תאים, יש להוסיף 200 מיקרוליטר לבאר של 0.25% טריפסין-EDTA לתרביות שנשטפו ב-PBS ולדגור ב-37 מעלות צלזיוס. להתסיס את התרביות כל 10 דקות על ידי pipeting נמרץ למעלה ולמטה כדי להקל על העיכול לפקח על המורפולוגיה של התרבית עם מיקרוסקופ תרבית תאים סטנדרטי.
לאחר מכן להעביר את הדגימות צינורות 2 מיליליטר ולהוסיף 200 מיקרוליטר של תא גזע mesenchymal מדיום בסיסי כדי לעכב את טריפסין. לאחר צנטריפציה והשלכת הסופרנטנט, מקפיאים את הכדוריות בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס או ממשיכים ישירות לשלב הבא. הפשירו את כדורי התא, הוסיפו 500 מיקרוליטר של חיץ ליזיס ודגרו במשך 30 דקות על קרח.
הצנטריפוגה הבאה ב 16, 100 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולשמור את הדגימות על קרח. מבלי להפריע לפסולת כדורית, יש לפזר 50 מיקרוליטר של הסופרנאטנט לכל באר של תרבית רקמה שקופה בעלת 96 בארות בכפילויות. הוסף 50 מיקרוליטר של מגיב phosphatase אלקליין מוכן לבארות של צלחת תרבית רקמות 96 באר.
נערו את הצלחת לזמן קצר ודגרו עליה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, כשהיא מוגנת מאור. עצור את התגובה על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסידי 1-מולארי באמצעות פיפטה רב ערוצית. באמצעות קורא לוחות, קרא את הצפיפות האופטית ב 410 ננומטר.
לצורך כימות DNA, הפשירו את הדגימות הקפואות, צנטריפוגו אותן והניחו אותן על קרח. מבלי להפריע לפסולת כדורית, יש לפזר 50 מיקרוליטר של הסופרנאטנט ליזט התא לבארות של צלחת שחורה בת 96 בארות בכפילויות. הוסף את תקני ה- DNA בכפילויות.
לאחר מכן, השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להוסיף 50 מיקרוליטר של סוכן מכתים DNA, ולאחר מכן לדגור ולקרוא את עוצמת פלואורסצנטיות על פי הוראות היצרן. השתמש בערכי העקומה הסטנדרטיים כדי לקבוע ולהחיל את ההמרה של ערכי העוצמה הנמדדים לריכוזי ה- DNA. לבסוף, לנרמל את ערכי phosphatase אלקליין על ידי חלוקתם על ידי ריכוז ה- DNA המתאים של כל דגימה.
כימות פעילות פוספטאז אלקליין לאפיון הפוטנציאל האוסטאוגני של התרביות הראה כי פעילות הפופטאז הבסיסי המנורמל השתנתה מאוד בתנאים שונים עם מגמה של פעילות מוגברת עם ריכוזים גבוהים יותר של BMP-2 ורמה של 100 ננוגרם למיליליטר. רמות הפעילות הנמוכות ביותר זוהו עבור המצב המכיל 50 ננוגרם למיליליטר FGF-2. כתמים סגולים נרחבים ועזים יותר נצפו בנוכחות BMP-2 בהשוואה ל-FGF-2.
