शुरू करने के लिए, एचबीएम-एमएससी और जीएफपी-एचयूवीईसी सह-संस्कृति लें और पीबीएस के प्रति कुएं 200 माइक्रोलीटर के साथ एक बार धो लें। बीसीआईपी / एनबीटी सब्सट्रेट समाधान जोड़ें और समय-समय पर रंग विकास की निगरानी करते हुए संस्कृतियों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एक बार जब रंग गैर-ओस्टोजेनिक स्थितियों में विकसित होता है, तो तुरंत पीबीएस के प्रति कुएं में 200 माइक्रोलीटर के साथ धोया जाता है।
4% पैराफॉर्मलडिहाइड में नमूने को ठीक करने के बाद, दाग वाले नमूनों की रंगीन छवियां प्राप्त करें। सेल लाइसेट में एएलपी गतिविधि को मापने के लिए, पीबीएस के साथ धोए गए संस्कृतियों में 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के प्रति कुएं में 200 माइक्रोलीटर जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एक मानक सेल कल्चर माइक्रोस्कोप के साथ पाचन को सुविधाजनक बनाने और संस्कृति आकृति विज्ञान की निगरानी करने के लिए हर 10 मिनट में ऊपर और नीचे सख्ती से पाइप िंग करके संस्कृतियों को उत्तेजित करें।
फिर नमूनों को 2-मिलीलीटर ट्यूबों में स्थानांतरित करें और ट्रिप्सिन को रोकने के लिए 200 माइक्रोलीटर मेसेनकाइमल स्टेम सेल बेसल माध्यम जोड़ें। सतह पर तैरने वाले को सेंट्रीफ्यूज करने और फेंकने के बाद, छर्रों को 80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें या सीधे अगले चरण में आगे बढ़ें। सेल छर्रों को पिघलाएं, 500 माइक्रोलीटर लाइसिस बफर जोड़ें, और बर्फ पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
अगला सेंट्रीफ्यूज 16, 100 ग्राम पर 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर रखें और नमूने बर्फ पर रखें। किसी भी पेलेट मलबे को परेशान किए बिना, सतह पर तैरनेवाला के 50 माइक्रोलीटर को एक पारदर्शी ऊतक संस्कृति 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में डुप्लिकेट में वितरित करें। तैयार क्षारीय फॉस्फेट अभिकर्मक के 50 माइक्रोलीटर को 96-वेल ऊतक संवर्धन प्लेट के कुओं में जोड़ें।
प्लेट को संक्षेप में हिलाएं और इसे प्रकाश से सुरक्षित 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करके 1-मोलर सोडियम हाइड्रॉक्साइड के 100 माइक्रोलीटर जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकें। प्लेट रीडर का उपयोग करके, 410 नैनोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व पढ़ें।
डीएनए परिमाणीकरण के लिए, जमे हुए नमूनों को पिघलाएं, उन्हें सेंट्रीफ्यूज करें, और उन्हें बर्फ पर रखें। किसी भी पेलेट मलबे को परेशान किए बिना, सेल लाइसेट सुपरनैटेंट के 50 माइक्रोलीटर को डुप्लिकेट में एक काले 96-वेल प्लेट के कुओं में फेंक दें। डुप्लिकेट में डीएनए मानकों को जोड़ें।
इसके बाद, डीएनए स्टेनिंग एजेंट के 50 माइक्रोलीटर जोड़ने के लिए एक मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करें, फिर निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रतिदीप्ति तीव्रता को इनक्यूबेट करें और पढ़ें। डीएनए सांद्रता में मापा तीव्रता मूल्यों के रूपांतरण को निर्धारित करने और लागू करने के लिए मानक वक्र मूल्यों का उपयोग करें। अंत में, क्षारीय फॉस्फेट मूल्यों को प्रत्येक नमूने की संबंधित डीएनए एकाग्रता से विभाजित करके सामान्य करें।
संस्कृतियों की ओस्टोजेनिक क्षमता को चिह्नित करने के लिए क्षारीय फॉस्फेट गतिविधि का परिमाणीकरण से पता चला है कि सामान्यीकृत क्षारीय फॉस्फेट गतिविधि बीएमपी -2 की उच्च सांद्रता और 100 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर पर पठार के साथ बढ़ती गतिविधि की प्रवृत्ति के साथ स्थितियों में बहुत भिन्न होती है। 50 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर एफजीएफ -2 युक्त स्थिति के लिए सबसे कम गतिविधि स्तर की पहचान की गई थी। एफजीएफ -2 की तुलना में बीएमपी -2 की उपस्थिति में अधिक व्यापक और तीव्र बैंगनी धुंधलापन देखा गया था।
