Per iniziare, prendi la co-coltura hBM-MSCs e GFP-HUVEC e lava una volta con 200 microlitri per pozzetto di PBS. Aggiungere la soluzione di substrato BCIP/NBT e incubare le colture a 37 gradi Celsius monitorando periodicamente lo sviluppo del colore. Una volta che il colore si sviluppa in condizioni non osteogeniche, immediatamente lavato con 200 microlitri per pozzetto di PBS.
Dopo aver fissato i campioni in paraformaldeide al 4%, acquisire immagini a colori dei campioni colorati. Per quantificare l'attività ALP nei lisati cellulari, aggiungere 200 microlitri per pozzetto di 0,25% di tripsina-EDTA alle colture lavate con PBS e incubare a 37 gradi Celsius. Agitare le colture ogni 10 minuti con un vigoroso pipettaggio su e giù per facilitare la digestione e monitorare la morfologia della coltura con un microscopio per coltura cellulare standard.
Quindi trasferire i campioni in provette da 2 millilitri e aggiungere 200 microlitri di mezzo basale di cellule staminali mesenchimali per inibire la tripsina. Dopo aver centrificato e scartato il surnatante, congelare il pellet a 80 gradi Celsius o procedere direttamente alla fase successiva. Scongelare i pellet cellulari, aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi e incubare per 30 minuti sul ghiaccio.
Quindi centrifugare a 16, 100 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e mantenere i campioni su ghiaccio. Senza disturbare eventuali detriti pellettati, erogare 50 microlitri di surnatante in ciascun pozzetto di una piastra trasparente di coltura tissutale a 96 pozzetti in duplicati. Aggiungere 50 microlitri del reagente della fosfatasi alcalina preparato ai pozzetti della piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti.
Agitare brevemente la piastra e incubarla a 37 gradi Celsius per 10 minuti al riparo dalla luce. Interrompere la reazione aggiungendo 100 microlitri di idrossido di sodio 1-molare utilizzando una pipetta multicanale. Utilizzando un lettore di piastre, leggere la densità ottica a 410 nanometri.
Per la quantificazione del DNA, scongelare i campioni congelati, centrifugarli e metterli sul ghiaccio. Senza disturbare alcun detrito pellettato, erogare 50 microlitri del lisato di cellule surnatante nei pozzetti di una piastra nera da 96 pozzetti in duplicati. Aggiungi gli standard del DNA in duplicati.
Quindi, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 50 microlitri dell'agente colorante del DNA, quindi incubare e leggere l'intensità della fluorescenza secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare i valori della curva standard per determinare e applicare la conversione dei valori di intensità misurati alle concentrazioni di DNA. Infine, normalizzare i valori di fosfatasi alcalina dividendoli per la rispettiva concentrazione di DNA di ciascun campione.
La quantificazione dell'attività della fosfatasi alcalina per caratterizzare il potenziale osteogenico delle colture ha mostrato che l'attività della fosfatasi alcalina normalizzata variava notevolmente tra le condizioni con una tendenza all'aumento dell'attività con concentrazioni più elevate di BMP-2 e un plateau a 100 nanogrammi per millilitro. I livelli di attività più bassi sono stati identificati per la condizione contenente 50 nanogrammi per millilitro FGF-2. Una colorazione viola più estesa e intensa è stata osservata in presenza di BMP-2 rispetto a FGF-2.
