まず、hBM-MSCとGFP-HUVECの共培養を行い、PBSのウェルあたり200マイクロリットルで1回洗浄します。BCIP/NBT基質溶液を添加し、発色を定期的にモニタリングしながら、摂氏37度で培養物をインキュベートします。非骨形成条件下で色が発達したら、直ちにPBSのウェルあたり200マイクロリットルで洗浄した。
サンプルを4%パラホルムアルデヒドで固定した後、染色したサンプルのカラー画像を取得します。細胞溶解物中のALP活性を定量するには、PBSで洗浄した培養物に0.25%トリプシン-EDTAをウェルあたり200マイクロリットル加え、摂氏37度でインキュベートします。消化を促進し、標準的な細胞培養顕微鏡で培養形態をモニターするために、上下に激しくピペッティングして培養物を10分ごとに攪拌します。
次に、サンプルを2ミリリットルのチューブに移し、トリプシンを阻害するために200マイクロリットルの間葉系幹細胞基礎培地を追加します。遠心分離して上清を廃棄した後、ペレットを摂氏80度で凍結するか、次のステップに直接進みます。細胞ペレットを解凍し、500マイクロリットルの溶解バッファーを加え、氷上で30分間インキュベートします。
次に、16、100 Gで摂氏4度で10分間遠心分離し、サンプルを氷上に保ちます。ペレット状の破片を乱すことなく、50マイクロリットルの上清を透明組織培養96ウェルプレートの各ウェルに二重に分注します。調製したアルカリホスファターゼ試薬50マイクロリットルを96ウェル組織培養プレートのウェルに加える。
プレートを短く振って、光から保護された摂氏37度で10分間インキュベートします。マルチチャンネルピペットを用いて100マイクロリットルの1モル水酸化ナトリウムを加えて反応を停止させる。プレートリーダーを使用して、410ナノメートルの光学密度を読み取ります。
DNA定量のために、凍結サンプルを解凍し、遠心分離し、氷の上に置きます。ペレット状の破片を乱すことなく、50マイクロリットルの細胞ライセート上清を黒色の96ウェルプレートのウェルに二重に分注します。DNA標準を重複して追加します。
次に、マルチチャンネルピペットを使用して50マイクロリットルのDNA染色剤を添加し、製造元の指示に従ってインキュベートして蛍光強度を読み取ります。検量線値を使用して、測定された強度値のDNA濃度への変換を決定し、適用します。最後に、アルカリホスファターゼ値を各サンプルのそれぞれのDNA濃度で割って正規化します。
培養物の骨形成能を特徴付けるためのアルカリホスファターゼ活性の定量は、標準化されたアルカリホスファターゼ活性が条件によって大きく異なり、BMP-2の濃度が高いほど活性が増加する傾向があり、100ナノグラム/ミリリットルのプラトーであることが示されました。最も低い活性レベルは、50ナノグラム/ミリリットルのFGF-2を含む状態で同定された。FGF-2と比較してBMP-2の存在下で、より広範囲で強い紫色染色が観察された。
