먼저, hBM-MSCs 및 GFP-HUVECs 공동 배양을 취하고, PBS의 웰 당 200 마이크로리터로 한번 세척한다. BCIP/NBT 기질 용액을 첨가하고 섭씨 37도에서 배양을 배양하면서 주기적으로 발색을 모니터링합니다. 일단 색이 비-골형성 조건에서 발달하면, 즉시 PBS의 웰 당 200 마이크로리터로 세척한다.
4% 파라포름알데히드에 샘플을 고정한 후 염색된 샘플의 컬러 이미지를 획득합니다. 세포 용해물에서 ALP 활성을 정량화하려면 PBS로 세척한 배양물에 웰당 0.25%Trypsin-EDTA를 200마이크로리터 추가하고 섭씨 37도에서 배양합니다. 소화를 촉진하기 위해 위아래로 세게 피펫팅하여 10분마다 배양물을 교반하고 표준 세포 배양 현미경으로 배양 형태를 모니터링합니다.
그런 다음 샘플을 2밀리리터 튜브로 옮기고 200마이크로리터의 중간엽 줄기 세포 기본 배지를 추가하여 트립신을 억제합니다. 상층액을 원심 융합하고 버린 후, 펠렛을 섭씨 80도에서 동결 또는 다음 단계로 바로 진행하십시오. 세포 펠릿을 해동하고 500마이크로리터의 용해 완충액을 첨가하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다.
다음으로 섭씨 4도에서 10분 동안 16, 100G에서 원심분리하고 샘플을 얼음 위에 보관한다. 펠릿화된 파편을 방해하지 않고, 50 마이크로리터의 상청액을 투명 조직 배양 96-웰 플레이트의 각 웰에 이중으로 분주한다. 제조된 알칼리성 포스파타제 시약 50 마이크로리터를 96-웰 조직 배양 플레이트의 웰에 첨가한다.
접시를 잠깐 흔들어 섭씨 37도에서 빛으로부터 보호하여 10 분 동안 배양합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 100 마이크로 리터의 1 몰 수산화 나트륨을 첨가하여 반응을 중지하십시오. 플레이트 리더를 사용하여 410나노미터에서 광학 밀도를 읽습니다.
DNA 정량화를 위해 냉동 샘플을 해동하고 원심분리한 다음 얼음 위에 놓습니다. 펠릿 파편을 방해하지 않고 50마이크로리터의 세포 용해물 상청액을 검은색 96웰 플레이트의 웰에 이중으로 분주합니다. DNA 표준물질을 중복으로 추가합니다.
다음으로, 다중 채널 피펫을 사용하여 50 마이크로 리터의 DNA 염색제를 첨가 한 다음 제조업체의 지침에 따라 배양하고 형광 강도를 읽습니다. 표준 곡선 값을 활용하여 측정된 강도 값을 결정하고 DNA 농도에 대한 변환을 적용합니다. 마지막으로, 알칼리성 포스파타제 값을 각 샘플의 각 DNA 농도로 나누어 정규화합니다.
배양물의 골형성 가능성을 특성화하기 위한 알칼리성 포스파타제 활성의 정량화는 표준화된 알칼리성 포스파타제 활성이 BMP-2 농도가 높을수록 활성이 증가하는 추세와 밀리리터당 100나노그램의 정체기로 조건에 따라 크게 달라지는 것으로 나타났습니다. 가장 낮은 활성 수준은 밀리리터당 50 나노그램 FGF-2를 함유하는 병태에 대해 확인되었다. FGF-2와 비교하여 BMP-2의 존재 하에서 더 광범위하고 강렬한 보라색 염색이 관찰되었다.
