For å begynne, ta hBM-MSC og GFP-HUVECs samkultur og vask en gang med 200 mikroliter per brønn PBS. Legg til BCIP / NBT-substratløsningen og inkuber kulturene ved 37 grader Celsius mens du periodisk overvåker fargeutviklingen. Når fargen utvikler seg under ikke-osteogene forhold, vaskes straks med 200 mikroliter per brønn av PBS.
Etter å ha festet prøvene i 4% paraformaldehyd, skaff fargebilder av de fargede prøvene. For å kvantifisere ALP-aktiviteten i cellelysater, tilsett 200 mikroliter per brønn på 0,25% Trypsin-EDTA til kulturen vasket med PBS og inkuber ved 37 grader Celsius. Agiter kulturene hvert 10. minutt ved kraftig pipettering opp og ned for å lette fordøyelsen og overvåke kulturmorfologien med et standard cellekulturmikroskop.
Overfør deretter prøvene til 2 milliliter rør og tilsett 200 mikroliter mesenkymalt stamcellebasalmedium for å hemme trypsinet. Etter sentrifisering og kassering av supernatanten, frys pellets ved 80 grader Celsius eller fortsett direkte til neste trinn. Tine cellepellets, tilsett 500 mikroliter lysisbuffer og inkuber i 30 minutter på is.
Neste sentrifuge ved 16, 100 G i 10 minutter ved fire grader Celsius og hold prøvene på is. Uten å forstyrre pelletert rusk, dispenser 50 mikroliter av supernatanten i hver brønn i en gjennomsiktig vevskultur 96-brønnplate i duplikater. Tilsett 50 mikroliter av det fremstilte alkaliske fosfatasereagenset til brønnene i 96-brønnsvevskulturplaten.
Rist platen kort og inkuber den ved 37 grader Celsius i 10 minutter beskyttet mot lys. Stopp reaksjonen ved å tilsette 100 mikroliter 1-molar natriumhydroksid ved hjelp av en flerkanalspipett. Bruk en plateleser til å lese den optiske tettheten ved 410 nanometer.
For DNA-kvantifisering, tine de frosne prøvene, sentrifuger dem og legg dem på is. Uten å forstyrre pelletert rusk, dispenserer 50 mikroliter av cellelysatsupernatanten i brønnene til en svart 96-brønnplate i duplikater. Legg til DNA-standardene i duplikater.
Bruk deretter en flerkanals pipette for å legge til 50 mikroliter av DNA-fargestoffet, inkuber deretter og les fluorescensintensiteten i henhold til produsentens instruksjoner. Bruk standard kurveverdier for å bestemme og anvende konverteringen av de målte intensitetsverdiene til DNA-konsentrasjonene. Til slutt normaliserer du de alkaliske fosfataseverdiene ved å dele dem med den respektive DNA-konsentrasjonen av hver prøve.
Kvantifisering av alkalisk fosfataseaktivitet for å karakterisere det osteogene potensialet til kulturene viste at den normaliserte alkaliske fosfataseaktiviteten varierte sterkt over forhold med en trend med økende aktivitet med høyere konsentrasjoner av BMP-2 og et platå ved 100 nanogram per milliliter. De laveste aktivitetsnivåene ble identifisert for tilstanden som inneholdt 50 nanogram per milliliter FGF-2. Mer omfattende og intens lilla farging ble observert i nærvær av BMP-2 sammenlignet med FGF-2.
