Para começar, faça a co-cultura hBM-MSCs e GFP-HUVECs e lave uma vez com 200 microlitros por poço de PBS. Adicionar a solução de substrato BCIP/NBT e incubar as culturas a 37 graus Celsius enquanto monitora periodicamente o desenvolvimento da cor. Uma vez que a cor se desenvolve em condições não osteogênicas, imediatamente lavado com 200 microlitros por poço de PBS.
Após a fixação das amostras em paraformaldeído a 4%, adquirir imagens coloridas das amostras coradas. Para quantificar a atividade da ALP em lisados celulares, adicionar 200 microlitros por poço de 0,25%Tripsina-EDTA às culturas lavadas com PBS e incubar a 37 graus Celsius. Agitar as culturas a cada 10 minutos pipetando vigorosamente para cima e para baixo para facilitar a digestão e monitorar a morfologia da cultura com um microscópio de cultura celular padrão.
Em seguida, transfira as amostras para tubos de 2 mililitros e adicione 200 microlitros de meio basal de células-tronco mesenquimais para inibir a tripsina. Depois de centrifundir e descartar o sobrenadante, congele os pellets a 80 graus Celsius ou prossiga diretamente para a próxima etapa. Descongele os pellets de células, adicione 500 microlitros de tampão de lise e incube por 30 minutos no gelo.
Em seguida, centrifugar a 16, 100 G por 10 minutos a quatro graus Celsius e manter as amostras no gelo. Sem perturbar nenhum detrito peletizado, distribua 50 microlitros do sobrenadante em cada poço de uma placa transparente de cultura de tecidos de 96 poços em duplicatas. Adicionar 50 microlitros do reagente preparado de fosfatase alcalina aos poços da placa de cultura de tecidos de 96 poços.
Agite brevemente a placa e incube-a a 37 graus Celsius por 10 minutos protegida da luz. Pare a reação adicionando 100 microlitros de hidróxido de sódio 1-molar usando uma pipeta multicanal. Usando um leitor de placas, leia a densidade óptica em 410 nanômetros.
Para a quantificação do DNA, descongele as amostras congeladas, centrifugue-as e coloque-as no gelo. Sem perturbar nenhum detrito peletizado, distribua 50 microlitros do sobrenadante lisado celular nos poços de uma placa preta de 96 poços em duplicatas. Adicione os padrões de DNA em duplicatas.
Em seguida, use uma pipeta multicanal para adicionar 50 microlitros do agente de coloração de DNA, incube e leia a intensidade da fluorescência de acordo com as instruções do fabricante. Utilizar os valores da curva padrão para determinar e aplicar a conversão dos valores de intensidade medidos às concentrações de DNA. Finalmente, normalizar os valores de fosfatase alcalina dividindo-os pela respectiva concentração de DNA de cada amostra.
A quantificação da atividade da fosfatase alcalina para caracterizar o potencial osteogênico das culturas mostrou que a atividade normalizada da fosfatase alcalina variou muito entre as condições, com uma tendência de aumento da atividade com maiores concentrações de BMP-2 e um platô em 100 nanogramas por mililitro. Os menores níveis de atividade foram identificados para a condição contendo 50 nanogramas por mililitro de FGF-2. Coloração roxa mais extensa e intensa foi observada na presença de BMP-2 em relação ao FGF-2.
