Для начала возьмите совместное культивирование hBM-MSCs и GFP-HUVECs и промойте один раз 200 микролитрами PBS. Добавьте субстрат BCIP/NBT и инкубируйте культуры при температуре 37 градусов Цельсия, периодически контролируя развитие цвета. Как только цвет разовьется в неостеогенных условиях, сразу же промывают 200 микролитрами на лунку PBS.
После фиксации образцов в 4%-ном параформальдегиде приобретаются цветные изображения окрашенных образцов. Чтобы количественно оценить активность ЩФ в клеточных лизатах, добавьте 200 микролитров на лунку 0,25% трипсина-ЭДТА в культуры, промытые PBS, и инкубируйте при 37 градусах Цельсия. Перемешивайте культуры каждые 10 минут, энергично пипетируя вверх и вниз, чтобы облегчить пищеварение, и контролируйте морфологию культуры с помощью стандартного микроскопа для клеточных культур.
Затем переложите образцы в 2-миллилитровые пробирки и добавьте 200 микролитров базальной среды мезенхимальных стволовых клеток для ингибирования трипсина. После центрирования и удаления надосадочной жидкости заморозьте гранулы при температуре 80 градусов Цельсия или приступайте непосредственно к следующему этапу. Разморозьте клеточные гранулы, добавьте 500 микролитров буфера для лизиса и инкубируйте в течение 30 минут на льду.
Затем центрифугируйте при 16, 100 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и держите образцы на льду. Не повреждая гранулированный мусор, дозируйте по 50 микролитров надосадочной жидкости в каждую лунку 96-луночного планшета для прозрачной культуры тканей в двух экземплярах. Добавьте 50 микролитров приготовленного реагента щелочной фосфатазы в лунки 96-луночного планшета для культуры тканей.
Коротко встряхните тарелку и выдержите ее при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут в защищенном от света месте. Остановите реакцию, добавив 100 микролитров 1-молярного гидроксида натрия с помощью многоканальной пипетки. С помощью считывателя пластин считайте оптическую плотность на 410 нанометрах.
Для количественного определения ДНК разморозьте замороженные образцы, центрифугируйте их и поместите на лед. Не повреждая гранулированный мусор, нанесите 50 микролитров надосадочной жидкости клеточного лизата в лунки черного 96-луночного планшета в двух экземплярах. Добавьте стандарты ДНК в дубликатах.
Затем с помощью многоканальной пипетки добавьте 50 микролитров красителя ДНК, затем инкубируйте и считайте интенсивность флуоресценции в соответствии с инструкциями производителя. Используйте стандартные значения кривой для определения и применения преобразования измеренных значений интенсивности в концентрации ДНК. Наконец, нормализуйте значения щелочной фосфатазы, разделив их на соответствующую концентрацию ДНК в каждом образце.
Количественное определение активности щелочной фосфатазы для характеристики остеогенного потенциала культур показало, что нормализованная активность щелочной фосфатазы сильно варьировала в зависимости от условий с тенденцией к увеличению активности при более высоких концентрациях BMP-2 и плато на уровне 100 нанограммов на миллилитр. Самые низкие уровни активности были выявлены для состояния, содержащего 50 нанограммов на миллилитр FGF-2. Более обширное и интенсивное окрашивание пурпурным цветом наблюдалось в присутствии БМП-2 по сравнению с FGF-2.
