Börja med att ta hBM-MSC och GFP-HUVECs samkultur och tvätta en gång med 200 mikroliter per brunn PBS. Tillsätt BCIP/NBT-substratlösningen och inkubera kulturerna vid 37 grader Celsius samtidigt som färgutvecklingen övervakas regelbundet. När färgen utvecklas under icke-osteogena förhållanden, tvättas omedelbart med 200 mikroliter per brunn PBS.
Efter fixering av proverna i 4% paraformaldehyd, skaffa färgbilder av de färgade proverna. För att kvantifiera ALP-aktiviteten i celllysater, tillsätt 200 mikroliter per brunn av 0,25% Trypsin-EDTA till kulturerna tvättade med PBS och inkubera vid 37 grader Celsius. Agitera kulturerna var 10: e minut genom att kraftigt pipettera upp och ner för att underlätta matsmältningen och övervaka odlingsmorfologin med ett standardcellodlingsmikroskop.
Överför sedan proverna till 2-milliliter rör och tillsätt 200 mikroliter mesenkymalt stamcellsbasalmedium för att hämma trypsinet. Efter centrering och kassering av supernatanten, frys pelletsen vid 80 grader Celsius eller fortsätt direkt till nästa steg. Tina cellpelletsen, tillsätt 500 mikroliter lysbuffert och inkubera i 30 minuter på is.
Centrifugera sedan vid 16 100 G i 10 minuter vid fyra grader Celsius och håll proverna på is. Utan att störa något pelleterat skräp, fördela 50 mikroliter av supernatanten i varje brunn på en transparent vävnadskultur 96-brunnsplatta i duplikat. Tillsätt 50 mikroliter av det beredda alkaliska fosfatasreagenset till brunnarna på vävnadsodlingsplattan med 96 brunnar.
Skaka plattan kort och inkubera den vid 37 grader Celsius i 10 minuter skyddad från ljus. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 100 mikroliter 1-molär natriumhydroxid med användning av en flerkanalig pipett. Använd en plattläsare, läs den optiska densiteten vid 410 nanometer.
För DNA-kvantifiering, tina de frysta proverna, centrifugera dem och lägg dem på is. Utan att störa något pelleterat skräp, fördela 50 mikroliter av celllysatsupernatanten i brunnarna på en svart 96-brunnsplatta i duplikat. Lägg till DNA-standarderna i duplikat.
Använd sedan en flerkanalig pipett för att tillsätta 50 mikroliter av DNA-färgningsmedlet, inkubera sedan och läs fluorescensintensiteten enligt tillverkarens instruktioner. Använd standardkurvvärdena för att bestämma och tillämpa omvandlingen av de uppmätta intensitetsvärdena till DNA-koncentrationerna. Slutligen normalisera de alkaliska fosfatasvärdena genom att dividera dem med respektive DNA-koncentration för varje prov.
Kvantifiering av alkalisk fosfatasaktivitet för att karakterisera kulturernas osteogena potential visade att den normaliserade alkaliska fosfatasaktiviteten varierade kraftigt över förhållanden med en trend av ökande aktivitet med högre koncentrationer av BMP-2 och en platå vid 100 nanogram per milliliter. De lägsta aktivitetsnivåerna identifierades för tillståndet innehållande 50 nanogram per milliliter FGF-2. Mer omfattande och intensiv lila färgning observerades i närvaro av BMP-2 jämfört med FGF-2.
