Başlamak için, hBM-MSC'leri ve GFP-HUVEC'leri ortak kültürü alın ve PBS kuyusu başına 200 mikrolitre ile bir kez yıkayın. BCIP / NBT substrat çözeltisini ekleyin ve renk gelişimini periyodik olarak izlerken kültürleri 37 santigrat derecede inkübe edin. Renk osteojenik olmayan koşullarda geliştikten sonra, hemen PBS kuyusu başına 200 mikrolitre ile yıkanır.
Numuneleri% 4 paraformaldehit içinde sabitledikten sonra, lekeli numunelerin renkli görüntülerini elde edin. Hücre lizatlarındaki ALP aktivitesini ölçmek için, PBS ile yıkanmış kültürlere % 0.25 Tripsin-EDTA kuyusu başına 200 mikrolitre ekleyin ve 37 santigrat derecede inkübe edin. Sindirimi kolaylaştırmak ve kültür morfolojisini standart bir hücre kültürü mikroskobu ile izlemek için her 10 dakikada bir kültürleri kuvvetli bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleyerek çalkalayın.
Daha sonra numuneleri 2 mililitrelik tüplere aktarın ve Tripsin'i inhibe etmek için 200 mikrolitre mezenkimal kök hücre bazal ortamı ekleyin. Süpernatanı santrifize ettikten ve attıktan sonra, peletleri 80 santigrat derecede dondurun veya doğrudan bir sonraki adıma geçin. Hücre topaklarını çözün, 500 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
Bir sonraki santrifüj, 16, 100 G'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve numuneleri buz üzerinde tutun. Herhangi bir peletlenmiş kalıntıyı rahatsız etmeden, 50 mikrolitre süpernatantı şeffaf bir doku kültürü 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna kopyalar halinde dağıtın. Hazırlanan alkalen fosfataz reaktifinin 50 mikrolitresini 96 delikli doku kültürü plakasının kuyucuklarına ekleyin.
Plakayı kısaca çalkalayın ve ışıktan korunan 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Çok kanallı pipet kullanarak 100 mikrolitre 1 molar sodyum hidroksit ekleyerek reaksiyonu durdurun. Bir plaka okuyucu kullanarak, optik yoğunluğu 410 nanometrede okuyun.
DNA ölçümü için, dondurulmuş örnekleri çözün, santrifüj edin ve buzun üzerine yerleştirin. Herhangi bir peletlenmiş kalıntıyı rahatsız etmeden, 50 mikrolitre hücre lizat süpernatantını siyah bir 96 delikli plakanın kuyucuklarına kopyalar halinde dağıtın. DNA standartlarını kopyalar halinde ekleyin.
Daha sonra, 50 mikrolitre DNA boyama maddesi eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın, ardından üreticinin talimatlarına göre floresan yoğunluğunu inkübe edin ve okuyun. Ölçülen yoğunluk değerlerinin DNA konsantrasyonlarına dönüşümünü belirlemek ve uygulamak için standart eğri değerlerini kullanın. Son olarak, alkalen fosfataz değerlerini, her bir numunenin ilgili DNA konsantrasyonuna bölerek normalleştirin.
Kültürlerin osteojenik potansiyelini karakterize etmek için alkalen fosfataz aktivitesinin nicelleştirilmesi, normalleştirilmiş alkalen fosfataz aktivitesinin, daha yüksek BMP-2 konsantrasyonları ve mililitre başına 100 nanogramda bir plato ile artan aktivite eğilimi ile koşullar arasında büyük ölçüde değiştiğini göstermiştir. En düşük aktivite seviyeleri, mililitre FGF-2 başına 50 nanogram içeren durum için tanımlanmıştır. BMP-2 varlığında FGF-2'ye kıyasla daha yaygın ve yoğun mor boyama gözlendi.
