Name: TEV Protease-Mediated Elution and Denaturation Elution of the Chromatin Locus Purified from Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-11-17T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about TEV Protease-Mediated Elution and Denaturation Elution of the Chromatin Locus Purified from Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

tev protease-mediated elution and denaturation elution of the chromatin locus purified from saccharomyces cerevisiae

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae

Watch this Scientific Journal Video about TEV Protease-Mediated Elution and Denaturation Elution of the Chromatin Locus Purified from Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

TEV Protease-Mediated Elution and Denaturation Elution of the Chromatin Locus Purified from Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE 

TEV protease-medieret eluering og denaturering Elution af kromatin locus renset fra Saccharomyces cerevisiae

Frigør lexA CBP-kromatinringkomplekserne fra de magnetiske perler, der bruges til at rense kromatin enkeltkopi-genlocus ved at inkubere bierne med to mikroliter 6xHis-mærket rekombinant tobaksætsningsvirus eller TEV-protease. Efter adskillelse af bierne fra det endelige eluat ved hjælp af en magnetisk rackoverførsel indeholder eluatet indeholdende spaltede kromatinringe til et nyt 1,5 ml reaktionsrør. Placer igen rørene på et magnetisk stativ for at adskille resterende perler fra det endelige eluat.Resuspender perlerne i 750 mikroliter kold ammoniumcarbonatbuffer, før du opbevarer nogle prøver ved 20 Celsius til DNA- og proteinanalyse. Fra det endelige eluat skal du tage prøverne ud og opbevare dem ved 20 grader Celsius til DNA- og proteinanalyse. Tag endvidere prøver fra de resterende perler.Begynd denatureringselueringen ved at vaske magnetperlerne to gange i 750 mikroliter kold ammoniumcarbonatbuffer i 20 minutter hver, fire grader Celsius roterer ved 20 omdrejninger pr. Minut. Derefter tilsættes 500 mikroliter 0,5 molært ammoniumhydroxid til perlerne for at ekstrahere bundne lexA-kromatinkomplekser og inkubere i 30 minutter ved stuetemperatur. Adskil perlerne fra suspensionen ved hjælp af et magnetstativ og overfør eluatet til et reaktionsrør med lav binding.Inkuber det lavbindende reaktionsrør ved stuetemperatur i 30 minutter og adskil perlerne fra suspensionen ved hjælp af et magnetisk stativ. Når du er færdig, overføres eluatet til et reaktionsrør med lav binding. Resuspender perlerne i 750 mikroliter deioniseret vand og saml prøver til DNA- og proteinanalyse.Til sidst opnås DNA- og proteinanalyseprøver fra det endelige eluat. I undersøgelsen blev rensningseffektiviteten af ARS316-locus og rekombinationsstammen kvantificeret og sammenlignet med kontrolstedet PDC1. ARS316-locus viste lavere genopretning i gennemstrømningen sammenlignet med PDC1.Selvom en brøkdel af kromatinringe forblev bundet til TEV-perlerne på grund af ufuldstændig TEV-proteasespaltning, resulterede denatureringeluering i 80 til 90% ARS316 locus-gendannelse. Dette svarer til den høje berigelse af ARS316-molekyler i TEV-perler og denatureringselueringsfraktioner, når der tages højde for størrelsen af gærgenomet sammenlignet med kontrolstammen, der ikke viste nogen berigelse af ARS316-locus i nogen af de kvantificerede fraktioner. Efter TEV-eluering viste perlerne en højere genvindingsprocent af ARS316-locus, da TEV-spaltningseffektiviteten ikke var 100%Dette resulterede i, at en brøkdel af kromatinringe forblev bundet til perlerne.Imidlertid viste denatureringsundvigelsen 80 til 90% genopretning af ARS316-locus og rekombinationsstammen svarende til den høje berigelse af ARS316-molekyler, når der tages højde for størrelsen af gærgenomet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

TEV Protease-Mediated Elution and Denaturation Elution of the Chromatin Locus Purified from Saccharomyces cerevisiae

Locus-Specific Chromatin Isolation from Yeast Cells

Advancing Chromatin Research and Overcoming Limitations with a High-Enrichment Locus-Specific Chromatin Isolation Protocol (Video) | JoVE

Enkelt-kopi gen locus kromatin oprensning i Saccharomyces cerevisiae

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone ...

Yeast Cell Culture and Cell Harvesting for Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification

Yeast Cell Culture and Cell Harvesting for Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification (Video) | JoVE 

Gærcellekultur og cellehøstning til enkeltkopi-gen-locus-kromatinoprensning

Locus-Specific Chromatin Purification from Saccharomyces cerevisiae

Locus-Specific Chromatin Purification from Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE 

Locus-specifik kromatinoprensning fra Saccharomyces cerevisiae