Pour commencer, prenez le cerveau isolé des bébés souris euthanasiés et placez-le dans une boîte de Pétri de trois centimètres contenant du MEM froid avec EBSS et 2X PSN. Sous une lunette de dissection, séparez les hémisphères cérébraux, retirez et jetez le mésencéphale, l’hippocampe et les méninges. Placez les deux hémisphères corticaux dans un tube conique de 50 millilitres contenant cinq millilitres de MEM EBSS avec 2X PSN, et conservez sur de la glace.
Dans une hotte de culture tissulaire, aspirez le milieu du tube conique de 50 millilitres à l’aide d’une pipette, en laissant les morceaux de tissu cortical au fond. Ajoutez 10 millilitres de milieu de dissociation préchauffé à l’aide d’une pipette en verre enduit et triturez le tissu 10 à 20 fois. Transférez la suspension dans un bécher de 50 millilitres contenant une petite barre d’agitation et placez-la sur une plaque d’agitation.
Retirez ensuite le bécher, réglez-le à un angle de 30 degrés pendant trois minutes pour permettre au tissu de se déposer, puis transférez la suspension cellulaire dans un nouveau tube conique de 50 millilitres sur de la glace. Centrifugez le tube conique de 50 millilitres à 1000G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Remplacer le surnageant par un milieu de croissance gliale et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
Plaquez les cellules à une densité d’un million dans des boîtes de 10 centimètres traitées par culture cellulaire et incubez pendant 24 heures. Ensuite, remplacez le milieu par un milieu glial frais et laissez les cellules atteindre 100 % de confluence dans les deux semaines avant de les plaquer pour l’expérimentation. Plaquez 100 000 cellules gliales par puits dans des plaques à six puits et laissez-les atteindre une confluence de 80 % à 100 % pour l’infection à prions in vitro.
Exposez les homogénats de cerveau dilués à 20 % et le PBS à la lumière ultraviolette pendant 30 minutes. Aspirez le milieu de la glie à infecter et ajoutez 1,5 à 2 millilitres de milieu de croissance gliale avec 0,1% d’homogénat cérébral normal ou prion par puits. Après 72 heures, retirez le milieu, lavez les cellules avec du PBS et ajoutez un nouveau milieu de croissance gliale.
Aspirer soigneusement le tissu adipeux dans environ un millilitre de HBSS dans une solution de trypsine à 0,25 %, à l’aide d’une pipette sérologique. Transférez le tissu dans une boîte de Pétri de quatre centimètres contenant deux millilitres de milieu DMEM F-12 avec un mélange de Dnase-1, de collagénase et de dispase. Ensuite, coupez le tissu adipeux en petits morceaux à l’aide de ciseaux et incubez le mélange à 37 degrés Celsius pendant 1,5 heure.
Transférez le tissu dans un tube conique de 50 millilitres, triturez le tissu et granulez la fraction vasculaire stromale, qui apparaîtra rouge. Après avoir lavé le granulé avec du PBS stérile et l’avoir centrifugé pendant trois minutes, remettez le granulé en suspension dans un millilitre de milieu ADMSC. Ensuite, pipetez la suspension cellulaire à travers une passoire de 40 micromètres dans un tube conique stérile de 50 millilitres, pour éliminer les tissus non dissociés.
Ajoutez neuf millilitres de milieu ADMSC dans une boîte de 10 centimètres traitée par culture cellulaire. Pipetez la suspension cellulaire filtrée et incubez à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Changez de milieu le lendemain et passez les cellules une fois qu’elles atteignent 80 à 90 % de confluence.
Une fois que les cellules ont subi deux à trois passages, mettez-les en suspension dans trois à 10 millilitres de milieu et comptez à l’aide d’un hémocytomètre. Déposer 100 000 cellules par puits dans des plaques à six puits contenant des milieux ADMSC et incuber pendant la nuit, comme indiqué précédemment. Le lendemain, préparez le milieu ADMSC pour les cellules stimulées par les cytokines avec soit 10 nanogrammes par millilitre de TNF-alpha, soit 200 nanogrammes par millilitre d’IFN-gamma.
Créer des milieux ADMSC avec une concentration finale de 0,1 % d’homogénat cérébral infecté par des prions ou normal pour les échantillons de contrôle. Aspirez l’ancien milieu, ajoutez 1,5 millilitre de milieu contenant des cytokines ou de l’homogénat cérébral dans les puits correspondants en trois exemplaires, et remettez les plaques dans l’incubateur. Ensuite, lavez les cellules avec du PBS et isolez l’ARN en ajoutant 350 microlitres de tampon de lyse avec 1% de bêta-mercaptoéthanol dans chaque puits.
Retirez les lysats cellulaires à l’aide d’un élévateur de cellules et transcrivez inverser 25 nanogrammes d’ARN par échantillon et amplifiez l’ADN complémentaire. Plaque microglie BV2 à 50 000 cellules par puits ou glie mixte primaire à 100 000 cellules par puits dans une plaque à six puits. Traitez les cellules BV2 avec des milieux contenant 0,1 % de cerveau infecté par des prions ou le cerveau normal, homogénatez et incubez pendant 72 heures.
Après l’incubation, lavez les cellules deux fois avec du PBS pour éliminer l’homogénat cérébral restant. Ajoutez du milieu frais dans les cellules et remettez la plaque dans l’incubateur. Pour stimuler les ADMC, traitez-les avec 10 nanogrammes par millilitre de TNF-alpha pendant 24 heures avant de les co-cultiver avec BV2 ou une glie mixte.
Lavez les ADMC stimulés avec du PBS trois fois et faites tourner la suspension ADMSC comme démontré précédemment. Remplacez le média sur les cellules BV2 ou la glie mixte par deux millilitres par puits de média ADMSC, et placez des inserts pour les plaques à six puits avec une taille de pores de 0,4 micromètre dans la moitié des puits. Ajoutez deux millilitres de média ADMSC à chaque insert et ajoutez deux millilitres supplémentaires de média aux puits qui ne reçoivent pas d’inserts.
Lors de la granulation, remettez en suspension et comptez les ADMC, ajoutez 50 000 à 100 000 cellules à chaque insert et incuberez-les. À la fin de l’incubation, retirez et jetez les inserts ou remplacez-les dans une nouvelle plaque à six puits et lavez les inserts deux fois avec du PBS. Ajoutez le tampon fourni par le kit d’isolement de l’ARN aux cellules gliales ou BV2 mixtes et raclez les puits.
