Para comenzar, coloque la rata sacrificada sobre la superficie de disección con el lado ventral hacia arriba. Pellizque la capa de piel con pinzas estériles y haga cortes a nivel de la superficie, evitando dañar los órganos internos. Con unas tijeras de disección grandes y afiladas, haga un corte longitudinal a nivel de la superficie en el centro del abdomen.
Luego, a partir de ese corte, haz dos cortes horizontales más cortos, uno a cada lado. Con unas pinzas, retire la piel para exponer la cavidad abdominal. Cortar a través de la membrana peritoneal para exponer completamente los órganos internos en la cavidad abdominal con fácil acceso al intestino.
Con ayuda de unas tijeras y unas pinzas, localiza el estómago e identifica el duodeno, de aproximadamente dos a tres centímetros distal al mismo, que aparece como un segmento amarillento. El yeyuno proximal se encuentra aproximadamente de cuatro a cinco centímetros distal al ligamento de Treitz. Un hito entre el duodeno y el yeyuno.
Coloque el fragmento intestinal aislado en una placa de Petri de 10 centímetros. Enjuague el segmento intestinal deseado del mesenterio con 10 mililitros de PBS helado hasta que se elimine el contenido luminal. Sobre una toalla de papel, corta el segmento intestinal en trozos de dos centímetros de largo.
A continuación, abra cada pieza intestinal longitudinalmente para exponer el epitelio. Raspe la superficie luminal expuesta con un portaobjetos de microscopio de vidrio para eliminar las vellosidades. Coloque los trozos intestinales en la solución de EDTA sobre hielo y gírela cuatro grados centígrados durante 30 minutos en un revólver de tubo ajustado a 10 RPM.
En el microscopio de disección, vierta el contenido del tubo en una placa de Petri de 10 centímetros. Agregue cinco mililitros adicionales de PBS helado. Con pinzas finas, sostenga un segmento intestinal y agite vigorosamente para observar la liberación del epitelio en el PBS.
Inicialmente, el PBS contendrá principalmente vellosidades. Agite los fragmentos intestinales continuamente, deseche periódicamente las vellosidades que contengan PBS y agregue 10 mililitros de PBS fresco a los fragmentos intestinales. Continúe agitando los fragmentos y repita el paso de lavado del PBS hasta que las vellosidades ya no se liberen en el PBS.
Pero en cambio, el PBS contiene principalmente criptas. Deseche los fragmentos intestinales restantes y enriquezca el PBS restante en la placa de Petri para las criptas intestinales. En una campana de cultivo de tejidos, recoja las criptas que contienen PBS y filtre a través de un drenador de células de 70 micras.
Centrifugar el filtrado a 250 x g durante cinco minutos. A continuación, retire su sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en cinco milímetros de DMEM plus avanzado. Centrifugar de nuevo a 250 x g durante cinco minutos.
Y retire el sobrenadante, dejando 50 microlitros de medio con el gránulo. Resuspender el pellet en el medio restante y añadirlo a la alícuota del extracto de matriz extracelular o EME en hielo. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para suspender las criptas de manera uniforme en todo el EME, evitando hacer burbujas.
Coloque 50 microlitros de los domos EME en una placa de cultivo de tejidos de 35 milímetros. Se incubó a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante 20 minutos. Después de la incubación, agregue dos mililitros de medio organoide intestinal de rata, o RIOM, que contengan 10 micromolares de Y27632 y CHIR99021.
A continuación, para pasar los organoides intestinales de rata, aspire el medio de una placa que contenga organoides y agregue un mililitro de reactivo de disociación para liberar los organoides de los domos EME. Transfiera el reactivo de disociación con organoides fragmentados a un tubo cónico de 15 mililitros. Lavar la placa de cultivo con dos mililitros de DMEM plus avanzado y añadirla al tubo cónico de 15 mililitros que contiene los organoides fragmentados.
Con una pipeta de vidrio para pastos, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo de 15 a 20 veces para fragmentar los organoides. Centrifugar los organoides a 350 x g durante dos minutos y añadir 50 microlitros de solución desde el fondo del tubo en el EME. Después de mezclar la solución, coloque 50 microlitros de los domos EME en una placa de cultivo de tejidos de 35 milímetros e incube a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5% durante 20 minutos.
Después de la incubación, agregue dos mililitros de RIOM que contengan 10 micromolares de Y27632 y CHIR99021. Se muestran imágenes representativas de fragmentos de vellosidades y criptas. Las criptas son más pequeñas en tamaño en comparación con las vellosidades.
Las criptas plateadas se expanden durante los días siguientes y comienzan a brotar y diferenciarse entre los días cuatro y siete. Después de dos días de descongelación, un cultivo de organoides sano mostró la presencia tanto de esferoides como de organoides brotados. La misma línea de organoides después del paso mostró la presencia de dominios similares a criptas individuales.
