Para recubrir la placa con EME, diluya EME de 1 a 20 en frío Advanced DMEM+Para recubrir con colágeno, diluya cinco miligramos por mililitro de colágeno I en Advanced DMEM+ a 100 microgramos por mililitro. Cubrir con la placa con 200 microlitros de EME o colágeno diluido para cubrir la superficie del pocillo por completo e incubar durante una o dos horas a 37 grados centígrados. Para generar monocapas, aspire el medio de una placa de 35 milímetros que contenga organoides.
Agregue un mililitro de PBS e interrumpa el EME en los pocillos con una punta P1000, pipeteando hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 20 veces para aflojar todo el EME. Transfiera el contenido a un tubo cónico de 15 mililitros. Agregue un mililitro de PBS a la placa para recolectar organoides adicionales y transferirlos al mismo tubo cónico.
Centrifugar la muestra a 350 G durante dos minutos y eliminar el sobrenadante, incluido cualquier residuo de EME. Luego, agregue un mililitro de solución de tripsina al gránulo de organoide e incube a 37 grados centígrados durante dos minutos. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una punta P1000 y añadir dos mililitros de Advanced DMEM+ para neutralizar la tripsina.
Centrifugar a 350 G durante cinco minutos y aspirar el sobrenante antes de resuspender el gránulo en 4,8 mililitros de rIOM2D. Elimine el exceso de EME o colágeno en Advanced DMEM+ de los pocillos. A continuación, agregue 200 microlitros de organoides en rIOM2D y 10 micromolares Y27632 a cada pocillo prerrecubierto.
Después de 4 a 16 horas, recoja el medio y centrifugue a 1.000 G durante un minuto. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros y deseche el gránulo. Lave cada pocillo con 300 microlitros de PBS antes de agregar 200 microlitros del rIOM2D centrifugado a cada pocillo.
Cambie el rIOM2D cada dos o tres días, suspendiendo el uso de monocapas Y27632.2D plateadas en el EME que se reformaron fácilmente en pequeños esferoides cuando el EME se volvió a agregar a la parte superior de las celdas. Por el contrario, un sustrato de colágeno I fue insuficiente para reformar las estructuras 3D.
