Bleaching and Plating Caenorhabditis elegans P0 Generation Embryos onto RNAi-NGM plates

הכינו בעלי חיים לבדיקת התורשה של RNAi על ידי בחירת שלושה או ארבעה גרביד Caenorhabditis elegans בוגרים תחת לוחות NGM סטנדרטיים של 35 מ"מ הזרעים עם חיידקי OP50-1. לאחר ארבעה ימים, שטפו את התולעים הבוגרות הגרבידיות מהצלחות לצינורות של 1.5 מיליליטר באמצעות 800 מיקרוליטר של חיץ M9 בתוספת Triton X-100. חזור על הכביסה ומשוך את התולעים לתוך צינור אחד.

לאחר צנטריפוגה התולעים ב 1, 000 גרם במשך 1.5 עד שתי דקות, שואפים supernatant לעזוב 100 מיקרוליטר מבלי להפריע גלולת התולעת. לכל צינור המכיל את גלולת התולעת, להוסיף 650 מיקרוליטר של מים מזוקקים כפול. כדי לבודד את עוברי C.elegans מהאוכלוסייה שנאספה, הוסיפו 250 מיקרוליטר של תמיסת ההלבנה הטרייה שהוכנה והפעילו טיימר.

כל דקה עד שתי דקות, מערבלים היטב את הצינורות. לאחר חמש דקות, לפקח על השפלה של תולעים בוגרות תחת סטריאוסקופ. ממשיכים לערבל עד שהתולעים מומסות לחלוטין ונשארים רק עוברים.

זה לוקח בדרך כלל שש עד שבע דקות. מיד צנטריפוגה את הצינורות ב 1, 000 G במשך 1.5 דקות לשאוף את supernatant, משאיר כ 50 עד 100 מיקרוליטר של supernatant עם העוברים. הוסף מיליליטר אחד של חיץ M9 בתוספת Triton X-100 לעוברים ולמערבולת.

צנטריפוגו את המתלה וחזרו על השטיפה פעמיים. לאחר השטיפה הסופית, שואפים את הסופרנאטנט ומשאירים כ -100 מיקרוליטר בצינור. מערבלים את הצינורות עם עוברים מבודדים ופיפטה שני מיקרוליטרים מכל צינור פעמיים על שקופית זכוכית מסומנת.

ספרו את העוברים באמצעות מונה ספירה כדי להעריך את ריכוז העוברים למיקרוליטר. כדי להתחיל גידול אוכלוסייה מסונכרן למחצה, העבר כ -250 עוברים על כל צלחת RNAi NGM המכילה חיידקי E.coli HT115 עם GFP או וקטורי RNAi בקרה. הניחו לנוזל להיספג.

לדגור על דור ה-P naught שטופל ב-RNAi במשך ארבעה ימים בטמפרטורה של 21 מעלות צלזיוס.