Пассирование и оценка генерации P0 Caenorhabditis elegans для экспрессии GFP зародышевой линии

Начните приготовление агарозных подушечек, поместив каплю расплавленной 1%-ной агарозы на виниловую пластинку с помощью стеклянной пастеровской пипетки. Сориентируйте предметное стекло так, чтобы линии на пластинке были горизонтальными или вертикальными, и быстро поместите предметное стекло на агарозную каплю на 30 секунд. Снимите предметное стекло с пластинки и добавьте примерно пять микролитров свежеприготовленного пятимиллимолярного левамизола под стереоскоп.

Аккуратно переверните трубку с червями и переложите от 5 до 10 микролитров на агарозную подушечку, чтобы закрепить червей. Оценивайте количество червей по мере их добавления так, чтобы на одну репликацию приходилось примерно 40 червей. Выстройте червей в ряды с помощью ресниц и наденьте на предметное стекло стеклянную защитную стекло.

Изолируйте эмбрионы от оставшихся червей с помощью протокола обесцвечивания и поместите 250 эмбрионов на 35-миллиметровые пластины NGM, засеянные бактериями OP50-1. Под флуоресцентным стереоскопом используйте набор фильтров GFP и подсчитайте и запишите количество GFP-положительных и GFP-отрицательных червей на предметных стеклах для каждой реплики с помощью счетчика подсчета. Ручная оценка ядерного сигнала GFP в зародышевой линии для каждого поколения показала, что сайленсинг трансгена был полностью пенетрантным у червей P0 и F1, обработанных GFP RNAi.

В поколении F2 доля населения, демонстрирующего наследование сайленсинга GFP, составляла примерно 50%. К поколению F10 все черви экспрессировали GFP и наследование не было обнаружено.