mouse lens dissection and processing to study complex cell-to-cell interdigitations and the membrane architecture

Preparation and Immunofluorescence Staining of Bundles and Single Fiber Cells from the Cortex and Nucleus of the Eye Lens

Dissection et traitement du cristallin de souris pour étudier les interdigitations complexes de cellule à cellule et l’architecture membranaire

Commencez par positionner une souris euthanasiée pour l’énucléation de l’œil à l’aide d’une pince incurvée pour presser le tissu autour de l’œil afin de déplacer l’œil hors de l’orbite. Ensuite, soulevez et retirez l’œil, et transférez-le sur du PBS frais dans le plateau de dissection. À l’aide de ciseaux ultra fins, coupez le nerf optique le plus près possible du globe oculaire et insérez soigneusement une pince à épiler droite à pointe fine dans le globe oculaire par la sortie du nerf optique à la postérieur de l’œil.Maintenant, insérez des ciseaux à la partie postérieure de l’œil et commencez à faire une incision de la partie postérieure vers la jonction sclérale cornéenne, et continuez l’incision jusqu’à ce que la moitié de la jonction soit séparée. Appuyez doucement sur la cornée pour que le cristallin puisse sortir par l’incision. À l’aide d’une pince à épiler droite à pointe fine, retirez délicatement tous les gros morceaux de tissu de la lentille.Après avoir trouvé la région équatoriale, percez peu profondément la lentille, puis retirez la capsule de la lentille. Transférez les cellules de fibre de lentille dans une parabole de 60 millimètres avec 1% de paraformaldéhyde. À l’aide d’un scalpel tranchant, fendez la boule des cellules fibreuses en deux le long de son axe antérieur postérieur.Et puis coupez davantage les moitiés le long du même axe pour produire des quartiers. Utilisez la pince à épiler droite pour retirer la région du noyau du quart de cellule de la fibre du cristallin. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de 1% de paraformaldéhyde à une plaque de 48 puits.Transférez le cortex du cristallin dans la plaque et incubez pendant 15 minutes à température ambiante en agitant doucement à 300 tr/min. Après le blocage, ajoutez les anticorps primaires appropriés à la plaque à 48 puits et transférez les échantillons dans la solution d’anticorps primaire. Incubez les échantillons pendant la nuit à 4 degrés Celsius en agitant doucement ou en les transformant.Le lendemain, lavez les échantillons avec du PTX et incubez-les de la même manière avec des anticorps secondaires. Après avoir lavé les échantillons, ajoutez une goutte ou 50 microlitres de support de montage sur une lame de microscope chargée plus. Placez le mouchoir dans le support de montage.Et utilisez une pince à épiler pour séparer doucement les cellules fibreuses les unes des autres. Ensuite, placez délicatement une lamelle de recouvrement sur les cellules séparées et le support de montage. Après avoir retiré l’excédent de support, utilisez du vernis à ongles pour sceller les bords de la lamelle de couverture sur la lame avant la microscopie confocale.Après la dissection du cristallin et le retrait de la capsule du cristallin, transférez la masse cellulaire de la fibre sur le bout des doigts gantés humides et roulez doucement dans toutes les directions pour séparer le noyau du cristallin. Ensuite, transférez le noyau de la lentille dans une solution de paraformaldéhyde à 1 % fraîchement préparée dans une plaque à 48 puits et incubez pendant la nuit à 4 degrés Celsius en agitant doucement ou en procédant à une mutation. Le lendemain, transférez l’échantillon dans une boîte de 60 millimètres contenant 1 % de paraformaldéhyde et utilisez un scalpel tranchant pour diviser le noyau du cristallin le long de l’axe antérieur postérieur en deux, puis en quartiers.Ensuite, postfixez, bloquez, colorez et montez l’échantillon comme démontré précédemment Dans ces préparations, des faisceaux de cellules de fibres de lentilles avec des morphologies uniques sont trouvés dans différentes régions du cristallin. La coloration du réseau F-actine montre un enrichissement au niveau de la membrane cellulaire dans les fibres différenciées et matures tandis que les signaux F-actine sont présents dans le cytoplasme des fibres nucléaires. La microscopie électronique à balayage et les images confocïdales de cellules à fibres différenciées montrent des interdigitations à billes et à emboîtements avec de petites protubérances imbriquées, tandis que les fibres matures ont des palettes décorées de petites protubérances.Les images de microscopie électronique à balayage et de microscope confocal des cellules à fibres de lentilles nucléaires révèlent des protubérances imbriquées peu fréquentes et plus grandes sur les côtés courts des cellules où la membrane cellulaire est rugueuse et présente des interdigitations de languette et de rainure dans ces cellules à partir du centre du cristallin.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Mouse Lens Dissection and Processing to Study Complex Cell-to-Cell Interdigitations and the Membrane Architecture

Immunofluorescence Staining of Membrane Interdigitations in Lens Fiber Cells

Advancing Lens Biomechanics Research Through a Novel Protocol for Imaging Complex Interdigitations and Protein Staining (Video) | JoVE

Préparation et coloration par immunofluorescence de faisceaux et de cellules à fibres uniques du cortex et du noyau du cristallin

The lens is a transparent and ellipsoid organ in the anterior chamber of the eye that changes shape to finely focus light onto the retina to form a clear ...

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Biologie du développement