mouse lens dissection and processing to study complex cell-to-cell interdigitations and the membrane architecture

Preparation and Immunofluorescence Staining of Bundles and Single Fiber Cells from the Cortex and Nucleus of the Eye Lens

जटिल सेल-टू-सेल इंटरडिजिटेशन और मेम्ब्रेन आर्किटेक्चर का अध्ययन करने के लिए माउस लेंस विच्छेदन और प्रसंस्करण

आंख को सॉकेट से बाहर निकालने के लिए आंख के चारों ओर ऊतक को दबाने के लिए घुमावदार बल का उपयोग करके आंख न्यूक्लियेशन के लिए एक इच्छामृत्यु माउस की स्थिति से शुरू करें। फिर आंख को उठाएं और निकालें, और इसे विच्छेदन ट्रे में ताजा पीबीएस में स्थानांतरित करें। अल्ट्रा फाइन कैंची का उपयोग करके, ऑप्टिक तंत्रिका को नेत्रगोलक के जितना संभव हो उतना करीब काट लें, और आंख के पीछे ऑप्टिक तंत्रिका के निकास के माध्यम से सावधानीपूर्वक सीधे चिमटी को नेत्रगोलक में डालें।अब, आंख के पीछे कैंची डालें और कॉर्नियल स्क्लरल जंक्शन की ओर पीछे से चीरा लगाना शुरू करें, और जंक्शन के आधे हिस्से को अलग होने तक चीरा जारी रखें। कॉर्निया पर धीरे से धक्का दें ताकि लेंस चीरे के माध्यम से बाहर निकल सके। बारीक टिप स्ट्रेट चिमटी का उपयोग करके, लेंस से ऊतक के किसी भी बड़े टुकड़े को ध्यान से हटा दें।भूमध्यरेखीय क्षेत्र को खोजने के बाद, उथले ढंग से लेंस को छेददें, और फिर लेंस कैप्सूल को हटा दें। लेंस फाइबर कोशिकाओं को 1% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ 60 मिलीमीटर डिश में स्थानांतरित करें। एक तेज स्केलपेल का उपयोग करके, फाइबर कोशिकाओं की गेंद को इसके पूर्ववर्ती पीछे की धुरी के साथ आधे में विभाजित करें।और फिर क्वार्टर बनाने के लिए उसी धुरी के साथ हिस्सों को काट लें। लेंस फाइबर सेल क्वार्टर से नाभिक क्षेत्र को हटाने के लिए सीधे चिमटी का उपयोग करें। इसके बाद, 48-वेल प्लेट में 1% पैराफॉर्मलडिहाइड के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें।लेंस कॉर्टेक्स को प्लेट में स्थानांतरित करें और 300 आरपीएम पर कोमल झटकों के साथ कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। अवरुद्ध करने के बाद, 48-वेल प्लेट में उपयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें और नमूने को प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में स्थानांतरित करें। कोमल झटकों या उत्परिवर्तन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर नमूने को इनक्यूबेट करें।अगले दिन, नमूने को पीटीएक्स के साथ धोएं, और इसी तरह, उन्हें द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें। नमूने धोने के बाद, प्लस चार्ज माइक्रोस्कोप स्लाइड पर एक बूंद या 50 माइक्रोलीटर माउंटिंग मीडिया जोड़ें। ऊतक को बढ़ते मीडिया में रखें।और फाइबर कोशिकाओं को धीरे-धीरे एक दूसरे से अलग करने के लिए चिमटी का उपयोग करें। फिर, धीरे से अलग कोशिकाओं और बढ़ते मीडिया के ऊपर एक कवर स्लिप रखें। अतिरिक्त मीडिया को हटाने के बाद, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी से पहले स्लाइड पर कवर स्लिप के किनारों को सील करने के लिए नेल पॉलिश का उपयोग करें।लेंस विच्छेदन और लेंस कैप्सूल हटाने के बाद, फाइबर सेल द्रव्यमान को गीली उंगलियों पर स्थानांतरित करें और लेंस नाभिक को अलग करने के लिए धीरे से सभी दिशाओं में रोल करें। फिर, लेंस न्यूक्लियस को 48-वेल प्लेट में ताजा बनाए गए 1% पैराफॉर्मलडिहाइड घोल में स्थानांतरित करें और कोमल झटकों या उत्परिवर्तन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। अगले दिन, नमूने को 1% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ 60 मिलीमीटर डिश में स्थानांतरित करें और लेंस नाभिक को पूर्ववर्ती पीछे की धुरी के साथ आधे में, फिर क्वार्टर में विभाजित करने के लिए एक तेज स्केलपेल का उपयोग करें।फिर, पोस्टफिक्स, ब्लॉक, दाग, और नमूना माउंट करें जैसा कि पहले दिखाया गया था इन तैयारियों में, अद्वितीय आकृति विज्ञान के साथ लेंस फाइबर कोशिकाओं के बंडल विभिन्न लेंस क्षेत्रों से पाए जाते हैं। एफ-एक्टिन नेटवर्क का धुंधलापन कोशिका झिल्ली पर विभेदित और परिपक्व तंतुओं में संवर्धन दिखाता है जबकि एफ-एक्टिन सिग्नल परमाणु फाइबर के साइटोप्लाज्म में मौजूद होते हैं। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और फाइबर कोशिकाओं को अलग करने की कॉन्फोकल छवियां छोटे इंटरलॉकिंग प्रोट्रूशियंस के साथ बॉल और सॉकेट इंटरडिजिटेशन दिखाती हैं, जबकि परिपक्व फाइबर में छोटे प्रोट्रूशियंस द्वारा सजाए गए पैडल होते हैं।परमाणु लेंस फाइबर कोशिकाओं की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप छवियों से कोशिकाओं के छोटे किनारों पर असंगत और बड़े इंटरलॉकिंग प्रोट्रूशियंस का पता चलता है जहां कोशिका झिल्ली खुरदरी होती है और लेंस के केंद्र से इन कोशिकाओं में जीभ और नाली इंटरडिजिटेशन होते हैं।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Mouse Lens Dissection and Processing to Study Complex Cell-to-Cell Interdigitations and the Membrane Architecture

Immunofluorescence Staining of Membrane Interdigitations in Lens Fiber Cells

Advancing Lens Biomechanics Research Through a Novel Protocol for Imaging Complex Interdigitations and Protein Staining (Video) | JoVE

आंख लेंस के कॉर्टेक्स और न्यूक्लियस से बंडलों और एकल फाइबर कोशिकाओं की तैयारी और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

The lens is a transparent and ellipsoid organ in the anterior chamber of the eye that changes shape to finely focus light onto the retina to form a clear ...