mouse lens dissection and processing to study complex cell-to-cell interdigitations and the membrane architecture

Preparation and Immunofluorescence Staining of Bundles and Single Fiber Cells from the Cortex and Nucleus of the Eye Lens

Dissezione ed elaborazione di lenti di topo per lo studio di complesse interdigitazioni cellula-cellula e dell'architettura di membrana

Inizia posizionando un topo sottoposto a eutanasia per l'enucleazione dell'occhio usando una pinza curva per premere il tessuto intorno all'occhio per spostare l'occhio fuori dall'orbita. Quindi sollevare e rimuovere l'occhio e trasferirlo su PBS fresco nel vassoio di dissezione. Usando forbici ultra sottili, taglia il nervo ottico il più vicino possibile al bulbo oculare e inserisci con cautela delle pinzette dritte a punta fine nel bulbo oculare attraverso l'uscita del nervo ottico nella parte posteriore dell'occhio.Ora, inserisci le forbici nella parte posteriore dell'occhio e inizia a praticare un'incisione dalla parte posteriore verso la giunzione sclerale corneale e continua l'incisione fino a quando metà della giunzione non è stata separata. Spingere delicatamente sulla cornea in modo che il cristallino possa uscire attraverso l'incisione. Usando una pinzetta dritta a punta fine, rimuovere con cautela eventuali pezzi di tessuto di grandi dimensioni dalla lente.Dopo aver trovato la regione equatoriale, forare superficialmente la lente, quindi rimuovere la capsula della lente. Trasferire le celle della fibra del cristallino in un piatto da 60 millimetri con l'1% di paraformaldeide. Usando un bisturi affilato, dividere la palla delle cellule della fibra a metà lungo il suo asse anteriore posteriore.E poi tagliare ulteriormente le metà lungo lo stesso asse per produrre quarti. Usa le pinzette diritte per rimuovere la regione del nucleo dal quarto delle cellule della fibra del cristallino. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di paraformaldeide all'1% a una piastra da 48 pozzetti.Trasferire la corteccia del cristallino sulla piastra e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente agitando delicatamente a 300 giri/min. Dopo il blocco, aggiungere gli anticorpi primari appropriati alla piastra a 48 pozzetti e trasferire i campioni nella soluzione anticorpale primaria. Incubare i campioni per una notte a 4 gradi Celsius con una leggera agitazione o mutazione.Il giorno successivo, lavare i campioni con PTX e, allo stesso modo, incubarli con anticorpi secondari. Dopo aver lavato i campioni, aggiungere una goccia o 50 microlitri di terreno di montaggio su un vetrino da microscopio più carico. Posizionare il tessuto nel mezzo di montaggio.E usa le pinzette per separare delicatamente le cellule della fibra l'una dall'altra. Quindi, posizionare delicatamente un vetrino coprioggetto sopra le celle separate e i supporti di montaggio. Dopo aver rimosso i supporti in eccesso, utilizzare lo smalto per unghie per sigillare i bordi del vetrino coprioggetto sul vetrino prima della microscopia confocale.Dopo la dissezione della lente e la rimozione della capsula della lente, trasferire la massa cellulare della fibra sulla punta delle dita guantate bagnate e arrotolare delicatamente in tutte le direzioni per separare il nucleo della lente. Quindi, trasferire il nucleo del cristallino in una soluzione di paraformaldeide all'1% appena preparata in una piastra a 48 pozzetti e incubare per una notte a 4 gradi Celsius con una leggera agitazione o mutazione. Il giorno successivo, trasferire il campione in un piatto da 60 millimetri con paraformaldeide all'1% e utilizzare un bisturi affilato per dividere il nucleo del cristallino lungo l'asse anteriore posteriore a metà, quindi in quarti.Quindi, postfissare, bloccare, colorare e montare il campione come dimostrato in precedenza In queste preparazioni, si trovano fasci di cellule di fibre del cristallino con morfologie uniche da diverse regioni del cristallino. La colorazione della rete di F-actina mostra un arricchimento della membrana cellulare in fibre differenzianti e mature, mentre i segnali di F-actina sono presenti nel citoplasma delle fibre nucleari. La microscopia elettronica a scansione e le immagini confocali delle cellule delle fibre differenzianti mostrano interdigitazioni di sfere e prese con piccole sporgenze ad incastro, mentre le fibre mature hanno pale decorate da piccole sporgenze.Le immagini al microscopio elettronico a scansione e al microscopio confocale delle cellule delle fibre del cristallino nucleare rivelano sporgenze ad incastro poco frequenti e più grandi sui lati corti delle cellule, dove la membrana cellulare è ruvida e presenta interdigitazioni a linguetta e scanalatura in queste cellule dal centro della lente.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Mouse Lens Dissection and Processing to Study Complex Cell-to-Cell Interdigitations and the Membrane Architecture

Immunofluorescence Staining of Membrane Interdigitations in Lens Fiber Cells

Advancing Lens Biomechanics Research Through a Novel Protocol for Imaging Complex Interdigitations and Protein Staining (Video) | JoVE

Preparazione e colorazione in immunofluorescenza di fasci e cellule a fibra singola dalla corteccia e dal nucleo del cristallino dell'occhio

The lens is a transparent and ellipsoid organ in the anterior chamber of the eye that changes shape to finely focus light onto the retina to form a clear ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo