Для начала наденьте средства индивидуальной защиты, в том числе средства защиты глаз, хирургическую маску и перчатки без латекса. Приготовьте 20 миллилитров мышиной нейробластомы или клеток BHK-21 до концентрации 3,0 умножить на 10 пятых клеток на миллилитр в EGM. Храните подготовленные ячейки в холоде до тех пор, пока они не будут готовы к использованию.
Далее подготавливают вирус CVS-11, разбавляя его в EGM. Следите за тем, чтобы приготовленный вирус оставался холодным до использования. Очистите камеру для измерения влажности и предметные стекла микроскопа, покрытые политетрафторэтиленом, 70%-ным этанолом и дайте им высохнуть на воздухе в шкафу биобезопасности.
После очистки добавьте дистиллированную воду на полоски впитывающей бумаги в камере предметного стекла, чтобы обеспечить постоянную влажность на протяжении всей процедуры. Карандашом подпишите каждый слайд необходимой идентификационной информацией, такой как номер партии, дата и тип ячейки. Поместите маркированные предметные стекла в камеру для хранения.
Затем нанесите 50 микролитров вирусного разведения на лунки на предметных стеклах микроскопа с помощью повторяющейся пипетки. Нанесите 50 микролитров клеточного разведения на каждую лунку, соблюдая осторожность, чтобы не загрязнить наконечник пипетки вирусом, уже находящимся в лунке. После этого закройте камеру влажности и поместите ее во влажный инкубатор при температуре от 34 до 36 градусов по Цельсию.
Затем извлеките предметное стекло из камеры влажности и тщательно отсосите надосадочную жидкость. Промойте предметное стекло в течение двух минут в банке, наполненной PBS, затем дайте ему высохнуть на воздухе. Поместите предметное стекло в холодную банку, наполненную ацетоном, чтобы зафиксировать образец.
Поместите банку в морозильную камеру с температурой минус 20 градусов по Цельсию, одобренную для легковоспламеняющихся материалов, не менее чем на один час. Как только ацетон испарится и предметное стекло высохнет, нанесите конъюгат флуоресцентных антител против бешенства в лунки предметного стекла и инкубируйте предметное стекло в течение 30 минут во влажном инкубаторе при температуре от 34 до 36 градусов Цельсия. Затем дважды промойте предметное стекло в банке из-под ПБС по две минуты каждая.
Высушите предметное стекло на воздухе и закрепите защитную крышку с помощью 0,05 молярного трисса, 0,15 молярного хлорида натрия в 20% глицериновом креплении. Используйте флуоресцентный микроскоп с 200-кратным увеличением для оценки инфекционности клеток. Далее удалите оставшиеся предметные стекла из инкубатора и камеры влажности.
Тщательно отсасывайте надосадочную жидкость из каждой лунки. Затем поместите предметные стекла в банку с PBS на одну-две минуты. Дайте предметным стеклам высохнуть на воздухе в течение примерно 30 минут, а затем храните их при температуре минус 80 градусов Цельсия до использования.
