Para comenzar, prepare la dilución en las muestras de suero o líquido cefalorraquídeo del paciente para su análisis. Prepare el conjugado requerido a la concentración de trabajo adecuada diluyéndolo en PBS con 0,05% de azul de Evans. En el caso de las pruebas de anticuerpos fluorescentes indirectos, recupere el número adecuado de portaobjetos de antígeno preparados necesarios para el ensayo.
Deje que los portaobjetos se descongelen y se sequen por completo. A continuación, coloque los portaobjetos en un frasco Coplin lleno de acetona y transfiéralos a un congelador de menos 20 grados centígrados aprobado para materiales inflamables durante dos horas o toda la noche. Después, retira los portaobjetos de la acetona y déjalos secar al aire.
Ahora, coloque los portaobjetos en la caja de la cámara de humedad dentro del gabinete de bioseguridad. Para mantener la humedad, agregue tiras absorbentes empapadas en agua destilada a la cámara. Aplique 50 microlitros de cada muestra de control, dilución de muestra o PBS al pocillo predeterminado.
Coloque la cámara de portaobjetos de humedad cerrada a 37 grados centígrados, incubadora de humedad de dióxido de carbono al 5% durante 30 minutos. Una vez hecho esto, retire la cámara de portaobjetos de humedad de la incubadora y transfiérala a un gabinete de bioseguridad. Con una punta de aspiración, aspire cuidadosamente el sobrenadante de cada pocillo sin perturbar la monocapa celular.
Después, aplique una gota de PBS en cada pocillo con una pipeta cuentagotas estéril. Aspire con cuidado el PBS y transfiera cada portaobjetos a un frasco Coplin lleno de PBS. A continuación, vuelva a colocar los portaobjetos en la caja de la cámara de humedad.
Aplique 50 microlitros del conjugado de anticuerpos antihumanos adecuado a cada pocillo e incube durante 30 minutos en una incubadora húmeda. Al final de la incubación, transfiera la cámara de humedad a una cabina de bioseguridad. Aspire el sobrenadante con una punta aspiradora.
Después, aplique una gota de PBS en cada pocillo con una pipeta cuentagotas estéril. Después de quitar el PBS, lave el portaobjetos dos veces en un frasco Coplin de PBS durante un total de 15 minutos. Una vez lavadas, deje que las guías se sequen al aire y, a continuación, monte una cubierta con medios de montaje.
Tome las diapositivas y léalas bajo microscopía fluorescente. Califique las muestras de negativo a cuatro más con muestras negativas que no muestran fluorescencia y cuatro muestras más que muestran una fluorescencia verde brillante. Asigne las muestras y el valor del punto final representado por el factor de dilución en el que la muestra muestra un grado positivo de uno a dos.
Después de la vacunación inicial, se observaron niveles elevados de inmunoglobulina M y G en las muestras de pacientes. Aproximadamente seis meses después de la vacunación, los niveles significativamente más bajos de ambos anticuerpos estaban presentes en las muestras de pacientes, pero los niveles de inmunoglobulina M habían disminuido casi por completo. 18 meses después de la vacunación, no se detectaron anticuerpos de inmunoglobulina M en las muestras de los pacientes.
Los niveles de inmunoglobulina G persistieron y se mantuvieron como los detectados a los seis meses después de la disminución inicial desde el punto de dos semanas.
