Para comenzar, use equipo de protección personal, que incluya protección para los ojos, una mascarilla quirúrgica y guantes que no sean de látex. Prepare 20 mililitros de neuroblastoma de ratón o células BHK-21 a una concentración de 3,0 veces 10 a la quinta célula por mililitro en EGM. Mantenga frías las celdas preparadas hasta que estén listas para usar.
A continuación, prepare el virus CVS-11 diluyéndolo en EGM. Asegúrese de mantener frío el virus preparado hasta que se use. Limpie la cámara de portaobjetos de humedad y los portaobjetos de microscopio recubiertos de politetrafluoroetileno con etanol al 70% y déjelos secar al aire en la cabina de bioseguridad.
Después de la limpieza, agregue agua destilada a las tiras de papel absorbente en la cámara de portaobjetos para garantizar una humedad constante durante todo el procedimiento. Con un lápiz, etiquete cada diapositiva con la información de identificación requerida, como el número de lote, la fecha y el tipo de celda. Coloque los portaobjetos etiquetados en la cámara de portaobjetos para su almacenamiento.
A continuación, aplique 50 microlitros de dilución de virus a los pocillos de los portaobjetos del microscopio utilizando una pipeta de repetición. Aplique 50 microlitros de dilución celular a cada pocillo, teniendo cuidado de no contaminar la punta de la pipeta con el virus que ya está en el pocillo. Después, cierre la cámara del portaobjetos de humedad y colóquela en la incubadora húmeda entre 34 y 36 grados centígrados.
A continuación, retire el portaobjetos de la cámara de humedad y aspire meticulosamente el sobrenadante. Lave el portaobjetos durante dos minutos en un frasco de coplin lleno de PBS, luego déjelo secar al aire. Coloque el portaobjetos en un frasco de coplin frío lleno de acetona para fijar la muestra.
Coloque el frasco en un congelador de menos 20 grados centígrados aprobado para materiales inflamables durante al menos una hora. Una vez que la acetona se evapore y el portaobjetos se seque, aplique anticuerpo fluorescente directo contra la rabia conjugado a los pocillos del portaobjetos e incube el portaobjetos durante 30 minutos en una incubadora húmeda de 34 a 36 grados centígrados. A continuación, lave el portaobjetos dos veces en un frasco de PBS durante dos minutos cada uno.
Seque al aire el portaobjetos y monte el cubreobjetos con el triss 0.05 molar, cloruro de sodio 0.15 molar en un montante de glicerol al 20%. Utilice un microscopio fluorescente con un aumento de 200 veces para evaluar la infectividad celular. A continuación, retire los portaobjetos restantes de la incubadora y la cámara de humedad.
Aspire el sobrenadante de cada pocillo con cuidado. Luego coloque las diapositivas en un frasco de coplin con PBS durante uno o dos minutos. Deje que los portaobjetos se sequen al aire durante unos 30 minutos y luego guárdelos a menos 80 grados centígrados hasta su uso.
