Après avoir isolé des noyaux uniques de tissus de mammifères congelés, percez soigneusement la feuille ronde de la cartouche de dissociateur à l’aide d’une pointe de pipette. Pour faciliter le nettoyage du gradient de saccharose, retirez 900 microlitres de suspension de noyaux de la cartouche et ajoutez-les à 500 microlitres de solution de coussin de saccharose ou de SCS préparée dans un tube de deux millilitres. Bien mélanger en pipetant jusqu’à ce que le mélange soit homogène.
Ensuite, tenez le tube en biais et ajoutez soigneusement 1 400 microlitres de mélange SCS en suspension de noyaux goutte à goutte sur 500 nouveaux microlitres de SCS, créant ainsi une séparation de phase clairement visible. Fermez soigneusement le tube et replacez-le sur la glace sans perturber la séparation de phase. Faites tourner délicatement les tubes à 13 000 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse pré-refroidie.
Retirez le surnageant sans déranger la palette et remettez soigneusement la palette en suspension dans 50 microlitres de NSR glacé. Tirez les deux palettes du même échantillon dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Ajoutez 900 microlitres de NSR glacé à un volume total d’un millilitre et mélangez bien en pipetant.
Centrifuger l’échantillon à 500 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius à l’aide d’une centrifugeuse à rotor à godets oscillants. Retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 100 microlitres de PBS. Pour le comptage, diluez 10 microlitres de suspension de noyaux dans 20 microlitres de PBS.
Ajouter 25 microlitres de solution de coloration à l’iodure de propidium dans un puits de mélange de la plaque de comptage fluorescente. Ajoutez ensuite 25 microlitres de suspension de noyaux dilués et mélangez bien par pipetage. Transférez 50 microlitres de l’échantillon coloré du puits de mélange au puits de chargement.
Chargez la plaque de comptage sur le compteur de cellules et commencez le comptage. Après le comptage, diluez les échantillons avec du PBS à la concentration souhaitée pour le séquençage de l’ARN à noyau unique. En utilisant le protocole d’isolement des noyaux partiellement automatisé, des noyaux de bonne qualité ont été obtenus sans signes de blabla, de débris ou d’agglutination.
Des diagrammes de violon représentant la distribution du nombre de gènes, du nombre d’UMI et du contenu mitochondrial dans chaque échantillon sont présentés. Les types de cellules attendus de chaque tissu ont été identifiés, et tous les animaux ont contribué à tous les clusters, ce qui indique une faible variabilité technique introduite par le protocole. De plus, les proportions cellulaires, le nombre d’UMI et le nombre de gènes étaient comparables dans les trois échantillons par type de tissu.