Per iniziare, scongelare rapidamente uno stock congelato di cellule SH-SY5Y in FBS. Integrato con DMSO al 10% e diluito dieci volte con terreni preriscaldati. Quindi centrifugare le cellule e rimuovere il surnatante.
Risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di terreno preriscaldato e le cellule seme in un pallone T25. Per preparare i vetrini coprioggetto rivestiti con PDL, applicare 600 microlitri di soluzione PDL da 50 microgrammi per millilitro a ciascun pozzetto di vetrini coprioggetto sterili camerati. Il volume di PDL aggiunto a ciascun pozzetto varia in base alle dimensioni del pozzetto.
Incubare i vetrini coprioggetto a temperatura ambiente per un'ora. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione PDL e sciacquare tre volte il vetrino coprioggetto con 1,8 millilitri di acqua distillata. Lasciare asciugare la camera rivestita all'aria per due ore.
Una volta che le cellule SH-SY5Y raggiungono l'80-90% di confluenza, dissociarle aggiungendo una soluzione di tripsina. Neutralizza la tripsina aggiungendo un terreno DMEM preriscaldato. Centrifugare la sospensione cellulare e risospendere il pellet in DMEM.
Conta le celle su un contatore di cellule automatizzato. Successivamente, seminare le cellule a una densità di 1,5 volte 10 al quarto di cellule per centimetro quadrato sul vetro di copertura della camera rivestito in PDL. Il primo e il terzo giorno, sostituire il terreno con DMEM integrato rispettivamente con cinque o 2% di FBS, 1% di antimicotico antibiotico e 10 micromolari RA o 95% di etanolo dello stesso volume di additivo per fungere da controllo del veicolo per la differenziazione.
Preparare uno stock di PKMO in DMEM libero di fenil-rosso preriscaldato integrato con due o 10% di FBS a seconda dello stato di differenziazione, 1% di antimicotico antibiotico e 20 hepes millimolari. Il sesto giorno, sciacquare le cellule due volte con i mezzi di imaging e incubare le cellule con la soluzione PKMO a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al 5% per 30 minuti. Dopo la colorazione, sciacquare le cellule tre volte con un mezzo di imaging preriscaldato.
Per il lavaggio finale, incubare le cellule per 30 minuti a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Dopo l'incubazione, sostituire il lavaggio finale con un terreno di imaging fresco preriscaldato contenente 20 hepes millimolari.