Para comenzar, descongele rápidamente un stock congelado de células SH-SY5Y en FBS. Suplementado con DMSO al 10% y diluido diez veces con medios precalentados. A continuación, centrifugar las células y eliminar el sobrenadante.
Vuelva a suspender el gránulo de celdas en cinco mililitros de medios precalentados y las células de semilla en un matraz T25. Para preparar los cubreobjetos recubiertos con PDL, aplique 600 microlitros de 50 microgramos por mililitro de solución de PDL a cada pocillo de cubreobjetos estériles con cámara. El volumen de PDL agregado a cada pocillo varía según el tamaño del pocillo.
Incubar los cubreobjetos a temperatura ambiente durante una hora. Después de la incubación, retire la solución de PDL y enjuague el cubreobjetos tres veces con 1,8 mililitros de agua destilada. Deje que la cámara recubierta se seque al aire durante dos horas.
Una vez que las células SH-SY5Y alcancen un 80 a 90 % de confluencia, disociarlas agregando una solución de tripsina. Neutralice la tripsina añadiendo un medio DMEM precalentado. Centrifugar la suspensión celular y volver a suspender el gránulo en DMEM.
Cuente las celdas en un contador de celdas automatizado. A continuación, siembre las células a una densidad de 1,5 veces 10 a la cuarta celda por centímetro cuadrado en el cubreobjetos con cámara recubierta de PDL. En el primer y tercer día, reemplace el medio con DMEM suplementado con 5 o 2 % de FBS respectivamente, 1 % de antibiótico antimicótico y 10 micromolares de AR o 95 % de etanol del mismo volumen de aditivo para que sirva como control del vehículo para la diferenciación.
Prepare un caldo de PKMO en DMEM libre de rojo fenilo precalentado suplementado con dos o 10% de FBS dependiendo del estado de diferenciación, 1% antibiótico antimicótico y 20 milimolares hepes. En el sexto día, enjuague las células dos veces con medios de imagen e incube las células con la solución PKMO a 37 grados centígrados y dióxido de carbono al 5% durante 30 minutos. Después de la tinción, enjuague las células tres veces con medios de imagen precalentados.
Para el lavado final, incubar las células durante 30 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de la incubación, reemplace el lavado final con un nuevo medio de imagen precalentado que contenga 20 milimolares hepes.