Åbn LightBox-softwaren til billedoptagelse. For at vælge laser- og filtersæt skal du bruge parametre til et orange farvestof ved at vælge det farvestof, der bruges i farvningen, fra farvelisten. Brug en oversigt til at klikke på live for at fokusere cellerne.
Når cellerne er i fokus, skal du justere indstillingerne for konfokal erhvervelse. Vælg derefter den rektangulære ROI-knap, og opret et interesseområde omkring et mitokondrier af interesse ved at klikke og trække for at forme regionen. Hvis du vil justere detektorgationen for stimuleret emissionsudtømning eller anskaffelse af stilstand, skal du vælge gating-menuen ud for den generelle menu eller klikke og holde nede for at føje menuen til visningen.
For stead erhvervelse, indstil excitationslaseren til 15 til 20% og stead deplettionslaseren til 20 til 25% med 10 linjeakkumuleringer. Brug en pixelopholdstid på fire mikrosekunder og en pixelstørrelse på 20 til 25 nanometer. Udfør tidsforløb ved at vælge rullemenuen Tid og derefter indstille antallet af gentagelser til fem og et tidsinterval på 25 eller 30 sekunder.
En Z-stak kan tages ved hjælp af lydstyrkeindstillingen og justere det ønskede Z-volumenområde og trinstørrelse. Åbn stead image deconvolution software til at deconvolute rå stead billeder med softwarealgoritmen. Når du har sikret dig, at mikroskopiske parametre er korrekte, skal du vælge ekspresknappen og indstille dekonvolutionstypen for hurtig, standard, aggressiv eller konservativ til forskellige grader af dekonvolutionskraft.
Udfør dekonvolutionen. Gem billederne i ICS2-format. I billede J skal du klikke på filen og derefter åbne for at åbne ICS2-filerne fra deconvolution-softwaren.
Vælg plugins, derefter segmentering efterfulgt af trænbar Weka-segmentering for at åbne de deconvoluted stead-billeder i det trænbare Weka-segmenteringsplugin. I segmenteringsindstillingerne skal du vælge Gaussisk sløring, membranfremskrivninger og sobelfilterfunktioner. Mærk den ene klasse som cristae og den anden som baggrund.
Tegn derefter en linje over strukturen, der skal tildeles til en af klasserne. Vælg derefter knappen Tilføj i højre side for enten cristae eller baggrund. Vælg derefter togklassificeringsknappen i venstre side for at generere et kort baseret på de oplysninger, der leveres til pluginet.
Klik på knappen Gem klassificering for at gemme klassificeringsindstillingerne til fremtidig segmentering. Brug cristae-sandsynlighedskortet til at reducere billedet i billede J til at generere en binær maske, og gå derefter til analyse og derefter analysere partikler. Til sidst skal du tegne en flerpunktslinje, justere linjetykkelsen til flere pixels bred og spline linjen, så den passer til mitokondrierne.
I denne undersøgelse er billeddannelse af mitokondrier i udifferentierede, retinsyredifferentierede SH-SY5Y-celler med time-lapse-billeddannelse som vist. De deconvoluted stead billeder kan bruges til at bestemme cristae periodicitet i et givet område og cristae størrelse og form målinger.
