Ouvrez le logiciel LightBox pour l’acquisition d’images. Pour sélectionner les jeux de laser et de filtres, utilisez les paramètres d’un colorant orange en sélectionnant le colorant utilisé dans la coloration dans la liste des colorants. À l’aide d’une vue d’ensemble, cliquez sur live pour mettre au point les cellules.
Une fois les cellules nettes, ajustez les paramètres d’acquisition confocale. Ensuite, sélectionnez le bouton rectangulaire ROI et créez une région d’intérêt autour d’une mitochondrie d’intérêt en cliquant et en faisant glisser pour façonner la région. Pour régler le déclenchement du détecteur en vue de l’épuisement de l’émission stimulée ou de l’acquisition de stead, à côté du menu général, sélectionnez le menu de contrôle ou cliquez longuement pour ajouter le menu à la vue.
Pour l’acquisition de stead, réglez le laser d’excitation sur 15 à 20 % et le laser de déplétion stead sur 20 à 25 % avec des accumulations de 10 lignes. Utilisez un temps d’arrêt des pixels de quatre microsecondes et une taille de pixel de 20 à 25 nanomètres. Effectuez un laps de temps en sélectionnant le menu déroulant Temps, puis en réglant le nombre d’itérations sur cinq et un intervalle de temps de 25 ou 30 secondes.
Une pile Z peut être prise à l’aide de l’option de volume et en ajustant la plage de volume Z et la taille de pas souhaitées. Ouvrez le logiciel de déconvolution d’image stead pour déconvoluer les images stead brutes avec l’algorithme logiciel. Après vous être assuré que les paramètres microscopiques sont corrects, sélectionnez le bouton express et définissez le type de déconvolution trop rapide, standard, agressif ou conservateur pour différents degrés de puissance de déconvolution.
Exécutez la déconvolution. Enregistrez les images au format ICS2. Dans l’image J, cliquez sur fichier puis ouvrez pour ouvrir les fichiers ICS2 du logiciel de déconvolution.
Sélectionnez les plug-ins, puis segmentation suivie de la segmentation Weka pouvant être entraînée pour ouvrir les images stead déconvolutées dans le plug-in de segmentation Weka pouvant être entraîné. Dans les paramètres de segmentation, sélectionnez les fonctions Flou gaussien, Projections membranaires et Filtre Sobel. Étiquetez une classe comme des cristae et l’autre comme arrière-plan.
Ensuite, tracez une ligne sur la structure à affecter à l’une ou l’autre des classes. Sélectionnez ensuite le bouton d’ajout sur le côté droit pour les cristae ou l’arrière-plan. Sélectionnez ensuite le bouton du classificateur de train sur le côté gauche pour générer une carte basée sur les informations fournies au plugin.
Cliquez sur le bouton Enregistrer le classificateur pour enregistrer les paramètres du classificateur en vue d’une segmentation ultérieure. Utilisez la carte de probabilité des crêtes pour mettre en seuil l’image dans l’image J afin de générer un masque binaire, puis accédez à analyser, puis analysez les particules. Enfin, tracez une ligne multi-points, ajustez l’épaisseur de la ligne à plusieurs pixels de large et cannelez la ligne pour l’adapter aux mitochondries.
Dans cette étude, l’imagerie des mitochondries dans des cellules SH-SY5Y différenciées par l’acide rétinoïque indifférencié avec l’imagerie en accéléré comme indiqué. Les images de stead déconvolutées peuvent être utilisées pour déterminer la périodicité des crêtes dans une zone donnée et les mesures de la taille et de la forme des crêtes.
