Öffnen Sie die LightBox-Software für die Bildaufnahme. Um die Laser- und Filtersätze auszuwählen, verwenden Sie die Parameter für einen orangefarbenen Farbstoff, indem Sie den für die Färbung verwendeten Farbstoff aus der Farbstoffliste auswählen. Klicken Sie in einer Übersicht auf live, um die Zellen zu fokussieren.
Sobald die Zellen scharf gestellt sind, passen Sie die konfokalen Aufnahmeeinstellungen an. Wählen Sie als Nächstes die rechteckige ROI-Schaltfläche aus und erstellen Sie einen Interessenbereich um ein Mitochondrium von Interesse, indem Sie klicken und ziehen, um den Bereich zu formen. Um das Detektor-Gating für stimulierte Emissionsverarmung oder Stead-Akquisition anzupassen, wählen Sie neben dem Menü "Allgemein" das Gating-Menü aus oder klicken und halten Sie die Maustaste gedrückt, um das Menü zur Ansicht hinzuzufügen.
Für die Stead-Erfassung stellen Sie den Anregungslaser auf 15 bis 20 % und den Stead-Depletion-Laser auf 20 bis 25 % mit 10 Linienakkumulationen ein. Verwenden Sie eine Pixelverweilzeit von vier Mikrosekunden und eine Pixelgröße von 20 bis 25 Nanometern. Führen Sie einen Zeitraffer durch, indem Sie das Dropdown-Menü "Zeit" auswählen und dann die Anzahl der Iterationen auf fünf und ein Zeitintervall von 25 oder 30 Sekunden festlegen.
Ein Z-Stapel kann mit der Volumenoption und der Einstellung des gewünschten Z-Volumenbereichs und der Schrittweite erstellt werden. Open Stead Image Deconvolution Software, um rohe Stead-Bilder mit dem Softwarealgorithmus zu dekonvolutieren. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die mikroskopischen Parameter korrekt sind, wählen Sie die Express-Taste und stellen Sie den Dekonvolutionstyp zu schnell, standardmäßig, aggressiv oder konservativ ein, um unterschiedliche Grade der Dekonvolutionsleistung zu erzielen.
Führen Sie die Dekonvolution aus. Speichern Sie die Bilder im ICS2-Format. Klicken Sie in Bild J auf Datei und dann auf Öffnen, um die ICS2-Dateien aus der Dekonvolutionssoftware zu öffnen.
Wählen Sie Plugins aus, dann Segmentierung gefolgt von trainierbarer Weka-Segmentierung, um die entfalteten Stead-Bilder im trainierbaren Weka-Segmentierungs-Plugin zu öffnen. Wählen Sie in den Segmentierungseinstellungen die Funktionen Gaußscher Weichzeichner, Membranprojektionen und Sobelfilter aus. Beschriften Sie eine Klasse als cristae und die andere als Hintergrund.
Ziehen Sie als Nächstes eine Linie über die Struktur, die einer der beiden Klassen zugewiesen werden soll. Wählen Sie dann die Schaltfläche "Hinzufügen" auf der rechten Seite für "Cristae" oder "Hintergrund". Wählen Sie dann auf der linken Seite die Schaltfläche für den Zugklassifikator aus, um eine Karte basierend auf den dem Plugin zur Verfügung gestellten Informationen zu generieren.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Klassifikator speichern, um die Klassifikatoreinstellungen für die zukünftige Segmentierung zu speichern. Verwenden Sie die Cristae-Wahrscheinlichkeitskarte, um den Schwellenwert für das Bild in Bild J zu definieren, um eine binäre Maske zu generieren, und gehen Sie dann zu Analysieren, dann analysieren Sie Partikel. Zum Schluss zeichnest du eine mehrpunktige Linie, stellst die Linienstärke auf mehrere Pixel Breite ein und verschneidest die Linie so, dass sie zu den Mitochondrien passt.
In dieser Studie wurde die Bildgebung von Mitochondrien in undifferenzierten, Retinsäure-differenzierten SH-SY5Y-Zellen mit Zeitraffer-Bildgebung gezeigt. Die dekonvolutierten Steadbilder können verwendet werden, um die Periodizität der Kristae in einem bestimmten Bereich und die Messung der Größe und Form der Kristae zu bestimmen.
