Comece pipetando uma gota de solução de bloqueio pronta para uso com soro de burro nas amostras de tecido. Em seguida, incubar as amostras por 30 minutos à temperatura ambiente. Remova o excesso de solução de bloqueio das lâminas batendo a borda contra uma superfície dura.
Diluir os anticorpos primários no tampão de diluição de anticorpos para preparar 100 microlitros da solução final para cada amostra. Configure os anticorpos, um tubo para cada anticorpo primário e um para cada anticorpo isocontrole. Espalhe uniformemente 100 microlitros de anticorpos isocontrole para uma amostra e 100 microlitros de mieloperoxidase e histona citrulina H3, ou diluição de anticorpos contra mieloperoxidase e elastase neutrofílica para a outra amostra.
Coloque as lâminas em uma câmara molhada e guarde-as durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, retire o excesso de solução de anticorpos primários das lâminas e empilha-os em uma cubeta. Enxaguar as lâminas três vezes por cinco minutos cada usando solução salina tamponada Tris com tween Para remover a solução de anticorpos primários restante.
Preparar dois anticorpos secundários distintamente fluorescentes, burro anti-cabra para mieloperoxidase e burro anti-coelho para coloração de histona H3 citrulinada. Diluir cada anticorpo para 7,5 microgramas por mililitro de concentração no tampão de diluição de anticorpos. Coloque as lâminas numa câmara húmida e distribua 100 microlitros da solução de anticorpos secundários em cada amostra.
Incubá-los por 30 minutos à temperatura ambiente protegida da luz. Remova o excesso de solução de anticorpos secundários tocando nas lâminas. Coloque os slides em um rack de slides.
Submergir as lâminas três vezes por cinco minutos cada em um frasco de coloração cheio de PBS para lavar os anticorpos não ligados. Prepare a solução e dilua-a até uma concentração de um micrograma por mililitro com água deionizada. Submergir a cremalheira deslizante em um frasco de coloração contendo a solução de dappy e incubar por cinco minutos à temperatura ambiente no escuro.
Em seguida, submerja a cremalheira deslizante em um frasco de coloração com PBS por cinco minutos para lavar qualquer solução de dappy em excesso. Por fim, monte as amostras utilizando lamínulas e meio de montagem. O anticorpo de histona H3 citrulinada ligou-se apenas às histonas extracelulares e não apresentou coloração de histonas intracelulares.
O anticorpo para mieloperoxidase humano ou específico de camundongo não apresentou coloração específica. Enquanto os anticorpos universais humanos e de camundongos mostraram boa coloração consistente para mieloperoxidase. Quando nenhum bloqueador foi utilizado, algumas amostras de camundongos apresentaram coloração mais inespecífica e parcialmente positiva.
Quando bloqueado, o tempo de bloqueio de cinco minutos apresentou bons resultados em relação ao tempo de bloqueio de 10 minutos. As temperaturas mais elevadas no micro-ondas e no banho-maria mostraram consistentemente moderada a boa recuperação antigênica. Já em banho-maria de 60 graus Celsius houve apenas coloração parcialmente positiva ou nenhuma.
Para a dupla coloração, obtiveram-se resultados mais favoráveis para as amostras incubadas em banho-maria a 96 graus Celsius. No entanto, exceder o tempo de incubação de 40 minutos a 96 graus Celsius resultou em coloração de anticorpos menos intensa.
