Uploaded: 2023-08-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Staining of Neutrophil Extracellular Traps in Tissue Samples at JoVE.com

immunofluorescence staining of neutrophil extracellular traps in tissue samples

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

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ऊतक के नमूनों में न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होना

ऊतक के नमूनों पर गधे के सीरम के साथ उपयोग के लिए तैयार ब्लॉकिंग समाधान की एक बूंद को पाइप करके शुरू करें। फिर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें। हार्ड सतह के खिलाफ किनारे को टैप करके स्लाइड से अतिरिक्त ब्लॉकिंग समाधान निकालें।प्रत्येक नमूने के लिए अंतिम समाधान के 100 माइक्रोलीटर तैयार करने के लिए एंटीबॉडी कमजोर पड़ने वाले बफर में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें। एंटीबॉडी सेट करें, प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए एक ट्यूब और प्रत्येक आइसोकंट्रोल एंटीबॉडी के लिए एक। समान रूप से एक नमूने में 100 माइक्रोलीटर आइसोकंट्रोल एंटीबॉडी फैलाएं, और 100 माइक्रोलीटर मायलोपेरोक्सीडेज और सिट्रूलिनेटेड हिस्टोन एच 3, या मायलोपेरोक्सीडेज और न्यूट्रोफिल इलास्टेस एंटीबॉडी कमजोर पड़ने को दूसरे नमूने में फैलाएं।स्लाइड्स को एक गीले कक्ष में रखें और उन्हें चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्टोर करें। अगले दिन, स्लाइड ्स से अतिरिक्त प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को टैप करें और उन्हें क्यूवेट में ढेर करें। शेष प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को हटाने के लिए ट्वीन के साथ ट्रिस बफर्ड सेलाइन का उपयोग करके स्लाइड को पांच मिनट के लिए तीन बार कुल्ला करें।दो अलग-अलग फ्लोरोसेंट द्वितीयक एंटीबॉडी तैयार करें, मायलोपेरोक्सीडेज के लिए गधा विरोधी बकरी और सिट्रूलिनेटेड हिस्टोन एच 3 धुंधला करने के लिए गधा विरोधी खरगोश। एंटीबॉडी कमजोर पड़ने वाले बफर में प्रत्येक एंटीबॉडी को 7.5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर एकाग्रता तक पतला करें। स्लाइड को एक गीले कक्ष में रखें और प्रत्येक नमूने पर द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के 100 माइक्रोलीटर वितरित करें।प्रकाश से सुरक्षित कमरे के तापमान पर उन्हें 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। स्लाइड ्स टैप करके अतिरिक्त द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान निकालें। स्लाइड्स को स्लाइड रैक में रखें.अनबाउंड एंटीबॉडी को धोने के लिए पीबीएस से भरे एक धुंधला जार में पांच मिनट के लिए स्लाइड ्स को तीन बार डुबोएं। डैपी घोल तैयार करें और इसे विआयनीकृत पानी के साथ एक माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता तक पतला करें। स्लाइड रैक को डैपी घोल वाले धुंधले जार में डुबोएं और अंधेरे में कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।इसके बाद, स्लाइड रैक को पीबीएस के साथ एक धुंधला जार में पांच मिनट के लिए डुबोएं ताकि किसी भी अतिरिक्त डैपी समाधान को धोया जा सके। अंत में, कवर स्लिप और माउंटिंग माध्यम का उपयोग करके नमूने माउंट करें। सिट्रूलिनेटेड हिस्टोन एच 3 एंटीबॉडी केवल बाह्य हिस्टोन से बंधा हुआ है और इंट्रासेल्युलर हिस्टोन का कोई धुंधलापन नहीं दिखाता है।मानव या माउस विशिष्ट मायलोपेरोक्सीडेज एंटीबॉडी ने कोई विशिष्ट धुंधलापन नहीं दिखाया। जबकि सार्वभौमिक मानव और माउस एंटीबॉडी ने मायलोपेरोक्सीडेज के लिए लगातार अच्छा धुंधलापन दिखाया। जब कोई ब्लॉकिंग एजेंट का उपयोग नहीं किया गया था, तो कुछ माउस नमूनों ने अधिक गैर-विशिष्ट और आंशिक सकारात्मक धुंधलापन दिखाया।ब्लॉक होने पर, पांच मिनट के ब्लॉकिंग टाइम ने 10 मिनट के ब्लॉकिंग टाइम की तुलना में अच्छे परिणाम दिखाए। माइक्रोवेव और पानी के स्नान में उच्च तापमान ने लगातार मध्यम से अच्छे एंटीजन पुनर्प्राप्ति दिखाई। जबकि 60 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में केवल आंशिक रूप से सकारात्मक और कोई धुंधलापन नहीं था।डबल धुंधलापन के लिए, 96 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान पर इनक्यूबेट किए गए नमूनों के लिए अधिक अनुकूल परिणाम प्राप्त किए गए थे। हालांकि, 96 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के इनक्यूबेशन समय से अधिक होने के परिणामस्वरूप कम तीव्र एंटीबॉडी धुंधला हो गया।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunofluorescence Staining of Neutrophil Extracellular Traps in Tissue Samples

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

मानव और माउस ऊतकों में न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप की इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...

﻿Autofluorescence Blocking and Antigen Retrieval in Tissue Samples

ï»¿Autofluorescence Blocking and Antigen Retrieval in Tissue Samples (Video) | JoVE 

ऊतक के नमूनों में ऑटोफ्लोरेसेंस ब्लॉकिंग और एंटीजन पुनर्प्राप्ति