单核细胞分离和单核细胞分化为单核细胞来源的树突状细胞

通过进入人血沉棕黄层并将 7 毫升转移到无菌的 15 毫升锥形管中开始分离外周血单核细胞。加入 6 毫升 PBS 溶液进行初步洗涤。在带有摆动转子的离心机中以 1、100 G 离心管 10 分钟，并在室温下制动。

使用牧场移液管收集白细胞悬浮液，并将其转移到新的无菌15毫升锥形管中。将PBS溶液加入白细胞悬浮液中，直至达到10毫升，然后通过上下移液轻轻混合。接下来，通过将 3 毫升密度梯度培养基放入新的无菌 15 毫升锥形管中来制备密度梯度溶液。

让它达到室温。在含有密度梯度介质的锥形管壁上缓慢加入 5 毫升稀释的白细胞悬浮液，以产生 5 到 3 的密度梯度分离。避免干扰介质。

通过使用带有摆动转子的离心机离心密度梯度介质中存在的悬浮液并关闭制动器进行梯度分离。接下来，使用牧场移液器小心地将多达 25 毫升的薄层 PBMC 转移到装有 PBS 的新 50 毫升锥形管中，并充分混合以去除残留的细胞和碎屑，在室温下以 600 G 离心样品 10 分钟。弃去上清液，使用PBS将样品填充至10毫升。

取等分试样对细胞进行计数。要去除血小板，请用普通制动器离心，并小心地倒置试管以弃去上清液。对于使用磁活化细胞分选的单核细胞 CD14 阳性分离，将细胞沉淀重悬于微珠缓冲液和 CD14 免疫磁珠中。

将细胞悬液在 4 摄氏度下孵育 15 分钟。要去除未结合的珠子，在室温下以 600 G 离心悬浮液 10 分钟之前，向第七个细胞添加 1 至 2 毫升微珠缓冲液，然后小心地倒置试管以弃去上清液。使用前准备LS色谱柱并将其放在磁铁上。

用 3 毫升微珠缓冲液冲洗，并立即将细胞沉淀重悬于 500 微升微珠缓冲液中，每次 10 次至第 8 个细胞。将细胞悬液加入LS柱入口，并将阴性细胞部分收集在柱出口下方的15毫升锥形管中。用三毫升微珠缓冲液洗涤色谱柱三次。

最终洗涤后，将色谱柱从磁铁上取下，并将其放在无菌的 15 毫升锥形管上。将 5 毫升微珠缓冲液移液到色谱柱入口中。立即将装有靶细胞的注射器柱塞插入色谱柱入口，并将细胞分配到色谱柱中。

然后离心CD14阴性和CD14阳性细胞组分并弃去上清液。为了将单核细胞分化为人单核细胞来源的树突状细胞，通过向CD14阳性细胞中加入适当体积的分化培养基，制备每毫升含有1.3乘以10至第六个细胞的细胞悬液。通过用牧场移液管移液重悬单核细胞。

将 1.3 倍于 10 至 6 个细胞的 24 孔板每孔悬浮液接种后，在 37 摄氏度的培养箱中用 5% 二氧化碳孵育。每两到三天更换培养基并补充新鲜细胞因子。为了收集分化的细胞，使用微量移液管将整个细胞悬液转移到无菌锥形管中，并用PBS洗涤培养瓶两次。

在室温下以180G离心锥形管10分钟后，将沉淀重悬于适当的培养基或缓冲液中用于实验设置。在单核细胞分化过程中，白细胞介素四和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子刺激改变了细胞表型。数据显示，人单核细胞来源的树突状细胞失去了表面标志物CD14的表达，主要由单核细胞表达，并获得了CD1A的显著表达。

由人树突状细胞表达的标志物。人单核细胞来源的树突状细胞也获得了MHC2 HLA-DR的更高表达，MHC2 HLA-DR是一种由人树突状细胞和其他抗原呈递细胞表达的抗原呈递分子。