Begin met het isoleren van mononucleaire cellen in perifeer bloed door toegang te krijgen tot de menselijke buffy-jas en zeven milliliter over te brengen in een steriele conische buis van 15 milliliter. Voeg zes milliliter PBS-oplossing toe voor een voorwasbeurt. Centrifugeer de buis gedurende 10 minuten bij 1,100 G in een centrifuge met zwenkrotor en rem af bij kamertemperatuur.
Vang de leukocytensuspensie op met behulp van een weidepipet en breng deze over in een nieuwe steriele conische buis van 15 milliliter. Voeg PBS-oplossing toe aan de leukocytensuspensie tot deze 10 milliliter bereikt en meng deze voorzichtig door op en neer te pipetteren. Bereid vervolgens de dichtheidsgradiëntoplossing voor door drie milliliter dichtheidsgradiëntmedium in een nieuwe steriele conische buis van 15 milliliter te plaatsen.
Laat het op kamertemperatuur komen. Voeg langzaam vijf milliliter verdunde leukocytensuspensie toe aan de conische buiswanden die het dichtheidsgradiëntmedium bevatten om een dichtheidsgradiëntscheiding van vijf tot drie te creëren. Vermijd het verstoren van het medium.
Ga verder met het scheiden van de helling door de in het dichtheidsgradiëntmedium aanwezige suspensie te centrifugeren met behulp van een centrifuge met een zwenkrotor en de rem eraf te zetten. Breng vervolgens voorzichtig maximaal 25 milliliter van de dunne laag PBMC's over in een nieuwe conische buis van 50 milliliter gevuld met PBS met behulp van een weidepipet en meng deze goed om resterende cellen en vuil te verwijderen, centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij 600 G met een normale rem. Gooi het supernatans weg en vul het monster tot 10 milliliter met PBS.
Neem een aliquot om de cellen te tellen. Om de bloedplaatjes te verwijderen, centrifugeert u ze met een normale rem en keert u de buis voorzichtig om om het supernatant weg te gooien. Voor positieve isolatie van monocyten CD14 met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering, resuspendeert u de celpellet in de microbeadsbuffer en CD14 immuno magnetische kralen.
Incubeer de celsuspensie gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Om de ongebonden parels te verwijderen, voegt u een tot twee milliliter microbeadsbuffer per één keer 10 toe aan de zevende cellen voordat u de suspensie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur centrifugeert bij 600 G. Bereid de LS-kolom voor en plaats deze voor gebruik op de magneet.
Spoel het af met drie milliliter microbeads buffer en resuspendeer de celpellet onmiddellijk in 500 microliter microbeads buffer per één keer 10 tot de achtste cellen. Voeg de celsuspensie toe aan de LS-kolominlaat en vang de negatieve celfractie op in een conische buis van 15 milliliter onder de kolomuitlaat. Was de kolom drie keer met drie milliliter microbeadbuffer.
Verwijder na de laatste wasbeurt de kolom van de magneet en plaats deze op een steriele conische buis van 15 milliliter. Pipetteer vijf milliliter microbeads in de kolominlaat. Steek de zuiger van de spuit gevuld met de doelcellen onmiddellijk in de kolominlaat en doseer de cellen in de kolom.
Centrifugeer vervolgens CD14 negatieve en CD14 positieve celfracties en gooi het supernatant weg. Voor de differentiatie van monocyten in van menselijke monocyten afgeleide dendritische cellen, bereidt u een celsuspensie met 1,3 keer 10 tot de zesde cellen per milliliter door het juiste volume differentiatiemedium toe te voegen aan de CD14-positieve cellen. Resuspendeer de monocyten door te pipetteren met een weidepipet.
Na het plateren van de 1,3 keer 10 tot de zesde cellen per milliliter suspensie per putje van een plaat met 24 putjes, incubeer in een kweekincubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Verander het kweekmedium en vul het om de twee tot drie dagen aan met verse cytokines. Om de gedifferentieerde cellen te verzamelen, brengt u de volledige celsuspensie over in een steriele conische buis met behulp van een micropipet en spoelt u de kweekkolf tweemaal met PBS.
Na het centrifugeren van de conische buizen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 180 G, resuspendeert u de pellet in de juiste media of buffer voor de experimentele opstelling. Tijdens de monocytdifferentiatie veranderden interleukine vier en granulocyt macrofaag koloniestimulerende factorstimulatie het celfenotype. Gegevens toonden aan dat van menselijke monocyten afgeleide dendritische cellen de expressie van oppervlaktemarker CD14 verloren, voornamelijk tot expressie gebracht door monocyten, en een significante expressie van CD1A kregen.
een marker die tot expressie wordt gebracht door menselijke dendritische cellen. Van menselijke monocyten afgeleide dendritische cellen verkrijgen ook een hogere expressie van MHC2 HLA-DR, een antigeenpresenterend molecuul dat tot expressie wordt gebracht door menselijke dendritische cellen en andere antigeenpresenterende cellen.