Commencez à isoler les cellules mononucléées du sang périphérique en accédant à la couche leucocytaire humaine et en transférant sept millilitres dans un tube conique stérile de 15 millilitres. Ajoutez six millilitres de solution PBS pour un lavage préliminaire. Centrifuger le tube pendant 10 minutes à 1,100 G dans une centrifugeuse avec un rotor pivotant et freiner à température ambiante.
Prélevez la suspension leucocytaire à l’aide d’une pipette Pasture et transférez-la dans un nouveau tube conique stérile de 15 millilitres. Ajouter la solution PBS à la suspension leucocytaire jusqu’à ce qu’elle atteigne 10 millilitres et la mélanger doucement en pipetant de haut en bas. Préparez ensuite la solution de gradient de densité en plaçant trois millilitres de milieu de gradient de densité dans un nouveau tube conique stérile de 15 millilitres.
Laissez-le atteindre la température ambiante. Ajouter lentement cinq millilitres de suspension leucocytaire diluée sur les parois coniques du tube contenant le milieu de gradient de densité pour créer une séparation de gradient de densité de cinq à trois. Évitez de déranger le support.
Procéder à la séparation en gradient en centrifugeant la suspension présente dans le milieu de gradient de densité à l’aide d’une centrifugeuse avec un rotor pivotant et le frein désactivé. Ensuite, transférez soigneusement jusqu’à 25 millilitres de la fine couche de PBMC dans un nouveau tube conique de 50 millilitres rempli de PBS à l’aide d’une pipette Pasture et mélangez-le bien pour éliminer les cellules résiduelles et les débris, centrifugez les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes à 600 G avec un frein normal. Jeter le surnageant et remplir l’échantillon à 10 millilitres à l’aide de PBS.
Prenez une aliquote pour compter les cellules. Pour retirer les plaquettes, centrifugez-les avec un frein normal et retournez soigneusement le tube pour éliminer le surnageant. Pour l’isolement positif des monocytes CD14 à l’aide d’un tri cellulaire activé magnétique, remettre en suspension la pastille cellulaire dans le tampon de microbilles et les billes immunomagnétiques CD14.
Incubez la suspension cellulaire pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Pour éliminer les billes non liées, ajoutez un à deux millilitres de tampon de microbilles par une fois 10 à la septième cellule avant de centrifuger la suspension à température ambiante pendant 10 minutes à 600 G.Ensuite, retournez soigneusement le tube pour éliminer le surnageant. Préparez la colonne LS et placez-la sur l’aimant avant utilisation.
Rincez-le avec trois millilitres de tampon à microbilles et remettez immédiatement en suspension la pastille cellulaire dans 500 microlitres de tampon à microbilles par une fois 10 jusqu’à la huitième cellule. Ajoutez la suspension cellulaire à l’entrée de la colonne LS et recueillez la fraction cellulaire négative dans un tube conique de 15 millilitres sous la sortie de la colonne. Lavez la colonne trois fois avec trois millilitres de tampon à microbilles.
Après le lavage final, retirez la colonne de l’aimant et placez-la sur un tube conique stérile de 15 millilitres. Pipeter cinq millilitres de microbilles tampon dans l’entrée de la colonne. Insérez immédiatement le piston de seringue rempli des cellules cibles dans l’entrée de la colonne et distribuez les cellules de la colonne.
Ensuite, centrifugez les fractions cellulaires CD14 négatives et CD14 positives et éliminez le surnageant. Pour la différenciation des monocytes en cellules dendritiques dérivées de monocytes humains, préparer une suspension cellulaire contenant 1,3 fois 10 à la sixième cellule par millilitre en ajoutant le volume approprié de milieu de différenciation aux cellules CD14 positives. Remettre les monocytes en suspension par pipetage à l’aide d’une pipette Pasture.
Après avoir plaqué la suspension de 1,3 fois 10 à 6 cellules par millilitre par puits d’une plaque à 24 puits, incuber dans un incubateur de culture à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Changez le milieu de culture et complétez-le avec des cytokines fraîches tous les deux à trois jours. Pour recueillir les cellules différenciées, transférez l’ensemble de la suspension cellulaire dans un tube conique stérile à l’aide d’une micropipette et lavez le flacon de culture deux fois avec du PBS.
Après avoir centrifugé les tubes coniques à température ambiante pendant 10 minutes à 180 G, remettre la pastille en suspension dans le milieu ou le tampon approprié pour le dispositif expérimental. Au cours de la différenciation des monocytes, la stimulation du facteur de stimulation des colonies de macrophages d’interleukine quatre et de granulocytes a modifié le phénotype cellulaire. Les données ont montré que les cellules dendritiques dérivées de monocytes humains perdaient l’expression du marqueur de surface CD14, principalement exprimé par les monocytes, et gagnaient une expression significative de CD1A.
Un marqueur exprimé par les cellules dendritiques humaines. Les cellules dendritiques dérivées de monocytes humains obtiennent également une expression plus élevée de MHC2 HLA-DR, une molécule présentatrice d’antigène exprimée par les cellules dendritiques humaines et d’autres cellules présentatrices d’antigènes.
