התחל לבודד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים על ידי גישה למעיל האפי האנושי והעברת שבעה מיליליטר לתוך צינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר. הוסף שישה מיליליטר של תמיסת PBS לשטיפה ראשונית. צנטריפוגה את הצינור במשך 10 דקות ב 1, 100 G בצנטריפוגה עם רוטור נדנדה, ולבלום בטמפרטורת החדר.
לאסוף את ההשעיה לויקוציטים באמצעות פיפטה מרעה ולהעביר אותו צינור חרוטי סטרילי חדש 15 מיליליטר. הוסף תמיסת PBS לתרחיף לויקוציטים עד שהוא מגיע ל -10 מיליליטר וערבב אותו בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לאחר מכן הכינו את תמיסת שיפוע הצפיפות על ידי הצבת שלושה מיליליטר של תווך שיפוע צפיפות לתוך צינור חרוטי סטרילי חדש של 15 מיליליטר.
תנו לו להגיע לטמפרטורת החדר. הוסף באיטיות חמישה מיליליטר של תרחיף לויקוציטים מדולל על דפנות הצינור החרוטי המכיל את מדיום שיפוע הצפיפות כדי ליצור הפרדה הדרגתית של חמש עד שלוש צפיפות. הימנע מלהפריע למדיום.
המשך להפרדת שיפוע על ידי צנטריפוגה של המתלים הקיימים בתווך שיפוע הצפיפות באמצעות צנטריפוגה עם רוטור נדנדה והבלם כבוי. לאחר מכן מעבירים בזהירות עד 25 מיליליטר מהשכבה הדקה של PBMCs לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר מלא PBS באמצעות פיפטה מרעה ומערבבים אותו היטב כדי להסיר תאים שיוריים ופסולת, צנטריפוגות את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב 600 G עם בלם רגיל. השליכו את הסופרנאטנט ומלאו את הדגימה ל-10 מיליליטר באמצעות PBS.
קח aliquot כדי לספור את התאים. כדי להסיר את טסיות הדם, צנטריפוגר אותם עם בלם רגיל בזהירות להפוך את הצינור כדי להשליך את supernatant. עבור בידוד חיובי CD14 מונוציטים באמצעות מיון תאים מופעל מגנטי, להשעות מחדש את גלולת התא במאגר microbeads וחרוזים מגנטיים CD14 immuno.
דוגרים על תרחיף התא למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. כדי להסיר את החרוזים הלא קשורים, הוסף מיליליטר אחד או שניים של חיץ microbeads לכל אחד כפול 10 לתא השביעי לפני צנטריפוגה את התרחיף בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות ב 600 G.ואז בזהירות להפוך את הצינור כדי להשליך את supernatant. הכינו את עמוד ה-LS והניחו אותו על המגנט לפני השימוש.
שטפו אותו עם שלושה מיליליטר של חיץ מיקרו-כדוריות ומיד השהו מחדש את גלולת התא ב-500 מיקרוליטר של חיץ מיקרו-כדוריות לתא אחד כפול 10 לתא השמיני. הוסף את מתלה התא לכניסת עמודת LS ואסוף את שבר התא השלילי בצינור חרוטי של 15 מיליליטר מתחת לשקע העמודה. שטפו את העמוד שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של מאגר מיקרו-חרוזים.
לאחר השטיפה הסופית, מוציאים את העמוד מהמגנט ומניחים אותו על צינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר. פיפטה חמישה מיליליטר של מיקרו-חרוזים חוצצים לתוך פתח העמוד. הכנס מיד את בוכנת המזרק המלאה בתאי היעד לכניסת העמודה ושחרר את התאים בעמודה.
לאחר מכן צנטריפוגה CD14 שלילי ושברי תאים חיוביים CD14 ולהשליך את supernatant. עבור התמיינות מונוציטים לתאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים אנושיים, הכינו תרחיף תאים המכיל 1.3 כפול 10 עד לתאים השישיים למיליליטר על ידי הוספת נפח מתאים של מדיום התמיינות לתאים חיוביים CD14. להשעות מחדש את המונוציטים על ידי pipetting עם פיפטה מרעה.
לאחר ציפוי 1.3 כפול 10 עד התאים השישיים לכל מיליליטר תרחיף לכל באר של צלחת 24 בארות, לדגור באינקובטור תרבית ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. שנו את מדיום התרבית והוסיפו לו ציטוקינים טריים כל יומיים-שלושה. כדי לאסוף את התאים המתמיינים, העבירו את כל תרחיף התא לצינור חרוטי סטרילי באמצעות מיקרו פיפטה ושטפו את בקבוק התרבית פעמיים עם PBS.
לאחר צנטריפוגה של צינורות חרוטי בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות ב 180 G, להשהות מחדש את הגלולה במדיה המתאימה או חיץ עבור ההתקנה הניסיונית. במהלך התמיינות המונוציטים, אינטרלוקין ארבע וגירוי גורם מעורר מושבת מקרופאגים גרנולוציטים שינו את פנוטיפ התא. הנתונים הראו כי תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים אנושיים איבדו את הביטוי של סמן פני השטח CD14, המתבטא בעיקר על ידי מונוציטים וקיבל ביטוי משמעותי של CD1A.
סמן המתבטא על ידי תאים דנדריטיים אנושיים. תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים אנושיים מקבלים גם ביטוי גבוה יותר של MHC2 HLA-DR, מולקולה מציגה אנטיגן המבוטאת על ידי תאים דנדריטיים אנושיים ותאים מציגי אנטיגן אחרים.
