단핵구 분리 및 단핵구 유래 수지상 세포로의 단핵구 분화

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October 20th, 2023

DOI :

10.3791/200350-v

October 20th, 2023

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Vanessa C. C. Luz^1,2, Zélia Silva^1,2, Patrícia Sobral^1,2,3, Ankit Tanwar^4,5, Rachel L. Paterson⁶, Paula A. Videira^1,2,7

¹Associate Laboratory i4HB - Institute for Health and Bioeconomy, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa, ²UCIBIO - Applied Molecular Biosciences Unit, Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa, ³LAQV and REQUIMTE, Departamento de Química, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade NOVA de Lisboa, ⁴Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, ⁵Department of Oncology, Albert Einstein College of Medicine, ⁶Stemmatters, Biotecnologia e Medicina Regenerativa SA, Parque de Ciência e Tecnologia Avepark, Zona Industrial da Gandra, ⁷CDG & Allies - Professionals and Patient Associations International Network (CDG & Allies - PPAIN), Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa

Transcript

인간의 버피 코트에 접근하고 멸균된 15밀리리터의 원뿔형 튜브에 7밀리리터를 옮겨 말초 혈액 단핵 세포를 분리하기 시작합니다. 예비 세척을 위해 6ml의 PBS 용액을 추가합니다. 스윙 로터가 있는 원심분리기에서 1, 100G에서 10분 동안 튜브를 원심분리하고 실온에서 브레이크를 밟습니다.

목초지 피펫을 사용하여 백혈구 현탁액을 수집하고 새로운 멸균 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 백혈구 현탁액이 10밀리리터가 될 때까지 PBS 용액을 첨가하고 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 다음으로, 3mL의 밀도 구배 배지를 새로운 멸균 15mL 원뿔형 튜브에 넣어 밀도 구배 용액을 준비합니다.

실온에 도달하도록 하십시오. 밀도 구배 배지가 들어 있는 원뿔형 튜브 벽에 5mL의 희석된 백혈구 현탁액을 천천히 추가하여 5-3 밀도 구배 분리를 만듭니다. 매체를 방해하지 마십시오.

스윙 로터와 브레이크가 꺼진 원심분리기를 사용하여 밀도 그래디언트 매체에 존재하는 서스펜션을 원심분리하여 그래디언트 분리를 진행합니다. 다음으로, 목초지 피펫을 사용하여 PBMC의 얇은 층 최대 25 밀리리터를 PBS로 채워진 새로운 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 조심스럽게 옮기고 잘 혼합하여 잔류 세포와 파편을 제거하고 일반 브레이크를 사용하여 600G에서 실온에서 10 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 상층액을 버리고 PBS를 사용하여 샘플을 10밀리리터까지 채웁니다.

세포를 계산하기 위해 부분 표본을 취하십시오. 혈소판을 제거하려면 일반 브레이크로 원심 분리하고 튜브를 조심스럽게 뒤집어 상층액을 버립니다. 자기 활성화 세포 분류를 사용한 단핵구 CD14 양성 분리의 경우, 세포 펠릿을 마이크로비즈 완충액 및 CD14 면역 마그네틱 비드에 재현탁시킵니다.

세포 현탁액을 섭씨 4도에서 15분 동안 배양합니다. 결합되지 않은 비드를 제거하려면 600G에서 실온에서 10분 동안 현탁액을 원심분리하기 전에 7번째 셀에 1 배 10당 1-2밀리리터의 마이크로비즈 버퍼를 추가한 다음 튜브를 조심스럽게 뒤집어 상층액을 버립니다. 사용하기 전에 LS 컬럼을 준비하여 자석 위에 올려 놓으십시오.

3 밀리리터의 마이크로비즈 완충액으로 헹구고 즉시 10 내지 8번째 세포당 500 마이크로리터의 마이크로비즈 완충액에 세포 펠릿을 재현탁시킨다. 셀 현탁액을 LS 컬럼 주입구에 추가하고 컬럼 출구 아래의 15밀리리터 원뿔형 튜브에서 음극 셀 분획을 수집합니다. 3mL의 마이크로비드 완충액으로 컬럼을 세 번 세척합니다.

최종 세척 후 자석에서 컬럼을 제거하고 멸균 된 15 밀리리터 원추형 튜브에 놓습니다. 피펫 5mL의 마이크로비즈가 컬럼 주입구에 완충액으로 주입됩니다. 표적 세포로 채워진 주사기 플런저를 컬럼 주입구에 즉시 삽입하고 컬럼에 세포를 분주합니다.

그런 다음 CD14 음성 및 CD14 양성 세포 분획을 원심분리하고 상층액을 버립니다. 인간 단핵구 유래 수지상 세포로의 단핵구 분화를 위해, CD14 양성 세포에 적절한 부피의 분화 배지를 첨가하여 밀리리터당 1.3 배 10 내지 6번째 세포를 포함하는 세포 현탁액을 제조한다. Pasture 피펫으로 피펫팅하여 단핵구를 재현탁합니다.

24 웰 플레이트의 웰 당 밀리리터 현탁액 당 1.3 배 10에서 6 번째 세포를 도운 후 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소로 배양 인큐베이터에서 배양합니다. 배양 배지를 교체하고 2-3일마다 신선한 사이토카인을 보충합니다. 분화된 세포를 수집하려면 마이크로 피펫을 사용하여 전체 세포 현탁액을 멸균 원뿔형 튜브로 옮기고 PBS로 배양 플라스크를 두 번 세척합니다.

원뿔형 튜브를 실온에서 180G에서 10분 동안 원심분리한 후 펠릿을 실험 설정에 적합한 배지 또는 완충액에 재현탁시킵니다. 단핵구 분화 동안, 인터루킨 4와 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 자극은 세포 표현형을 변화시켰다. 데이터에 따르면 인간 단핵구 유래 수지상 세포는 주로 단핵구에 의해 발현되는 표면 마커 CD14의 발현을 잃고 CD1A의 상당한 발현을 얻었습니다.

인간 수지상 세포에 의해 발현되는 마커. 인간 단핵구 유래 수지상 세포는 또한 인간 수지상 세포 및 기타 항원 제시 세포에 의해 발현되는 항원 제시 분자인 MHC2 HLA-DR의 더 높은 발현을 얻습니다.

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Keywords Monocyte Isolation

Peripheral Blood Mononuclear Cells

Density Gradient Separation

CD14 Positive Isolation

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