Comece a isolar as células mononucleares do sangue periférico acessando o revestimento humano e transferindo sete mililitros para um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Adicione seis mililitros de solução PBS para uma lavagem preliminar. Centrifugar o tubo por 10 minutos a 1, 100 G em uma centrífuga com rotor oscilante e frear à temperatura ambiente.
Recolher a suspensão de leucócitos utilizando uma pipeta de pastagem e transferi-la para um novo tubo cónico estéril de 15 mililitros. Adicione a solução de PBS à suspensão de leucócitos até atingir 10 mililitros e misture suavemente pipetando para cima e para baixo. Em seguida, prepare a solução de gradiente de densidade colocando três mililitros de meio de gradiente de densidade em um novo tubo cônico estéril de 15 mililitros.
Deixe atingir a temperatura ambiente. Adicione lentamente cinco mililitros de suspensão de leucócitos diluída nas paredes cônicas do tubo contendo o meio de gradiente de densidade para criar uma separação de gradiente de densidade de cinco a três. Evite perturbar o médium.
Proceder à separação do gradiente centrifugando a suspensão presente no meio de gradiente de densidade usando uma centrífuga com rotor oscilante e o freio desligado. Em seguida, transfira cuidadosamente até 25 mililitros da fina camada de PBMCs para um novo tubo cônico de 50 mililitros preenchido com PBS usando uma pipeta de pastagem e misture-o bem para remover células residuais e detritos, centrifugar as amostras à temperatura ambiente por 10 minutos a 600 G com um freio normal. Descarte o sobrenadante e preencha a amostra para 10 mililitros usando PBS.
Pegue uma alíquota para contar as células. Para remover as plaquetas, centrifuga-as com um freio normal e inverta cuidadosamente o tubo para descartar o sobrenadante. Para o isolamento positivo de monócitos CD14 usando a classificação de células ativadas por magnética, ressuspenda o pellet de células no tampão de microesferas e esferas imunomagnéticas CD14.
Incubar a suspensão celular por 15 minutos a quatro graus Celsius. Para remover as esferas não ligadas, adicione um a dois mililitros de tampão de microesferas por uma vez 10 às sétimas células antes de centrifugar a suspensão à temperatura ambiente por 10 minutos a 600 G. Em seguida, inverta cuidadosamente o tubo para descartar o sobrenadante. Prepare a coluna LS e coloque-a sobre o ímã antes de usar.
Enxágue com três mililitros de tampão de microesferas e ressuspenda imediatamente o pellet de células em 500 microlitros de tampão de microesferas por uma vez 10 até a oitava célula. Adicione a suspensão celular à entrada da coluna LS e colete a fração celular negativa em um tubo cônico de 15 mililitros abaixo da saída da coluna. Lave a coluna três vezes com três mililitros de tampão microesfera.
Após a lavagem final, retire a coluna do ímã e coloque-a em um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Pipetar cinco mililitros de microesferas tamponam na entrada da coluna. Insira imediatamente o êmbolo da seringa preenchido com as células alvo na entrada da coluna e distribua as células na coluna.
Em seguida, centrifugar as frações celulares CD14 negativo e CD14 positivo e descartar o sobrenadante. Para a diferenciação de monócitos em células dendríticas derivadas de monócitos humanos, prepare uma suspensão celular contendo 1,3 vezes 10 a sexta células por mililitro, adicionando o volume apropriado de meio de diferenciação às células CD14 positivas. Ressuspenda os monócitos por pipetagem com uma pipeta de pastagem.
Depois de plaquear a suspensão de 1,3 vezes 10 a sexta células por mililitro por poço de uma placa de 24 poços, incubar em uma incubadora de cultura a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Troque o meio de cultura e suplemente-o com citocinas frescas a cada dois ou três dias. Para coletar as células diferenciadas, transferir toda a suspensão celular para um tubo cônico estéril usando uma micropipeta e lavar o frasco de cultura duas vezes com PBS.
Após centrifugar os tubos cônicos à temperatura ambiente por 10 minutos a 180 G, ressuspenda o pellet no meio ou tampão apropriado para o arranjo experimental. Durante a diferenciação dos monócitos, a estimulação com fator estimulador da interleucina quatro e do fator estimulador de colônias de granulócitos macrófagos alterou o fenótipo celular. Os dados mostraram que as células dendríticas derivadas de monócitos humanos perderam a expressão do marcador de superfície CD14, expresso principalmente por monócitos e ganharam expressão significativa de CD1A.
um marcador expresso por células dendríticas humanas. Células dendríticas derivadas de monócitos humanos também obtêm maior expressão de MHC2 HLA-DR, uma molécula apresentadora de antígeno expressa por células dendríticas humanas e outras células apresentadoras de antígenos.
