Начните выделение мононуклеарных клеток периферической крови, получив доступ к охристой шерсти человека и переложив семь миллилитров в стерильную коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Добавьте шесть миллилитров раствора PBS для предварительного мытья. Центрифугируйте пробирку в течение 10 минут при давлении 1,100 G в центрифуге с качающимся ротором, и тормозите при комнатной температуре.
Соберите лейкоцитарную суспензию с помощью пипетки Pasture и переложите ее в новую стерильную коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Добавьте раствор PBS в лейкоцитарную суспензию до тех пор, пока она не достигнет 10 миллилитров, и аккуратно перемешайте его пипетированием вверх и вниз. Затем приготовьте раствор градиента плотности, поместив три миллилитра градиентной среды в новую стерильную коническую пробирку объемом 15 миллилитров.
Дайте ему нагреться до комнатной температуры. Медленно добавьте пять миллилитров разбавленной лейкоцитарной суспензии на стенки конической трубки, содержащей среду с градиентом плотности, чтобы создать разделение градиента плотности от пяти до трех. Не тревожьте среду.
Приступайте к градиентному разделению путем центрифугирования суспензии, присутствующей в среде с градиентом плотности, с помощью центрифуги с качающимся ротором и выключенным тормозом. Далее осторожно переложите до 25 миллилитров тонкого слоя PBMCs в новую 50 миллилитровую коническую трубку, заполненную PBS, с помощью пипетки Pasture и хорошо перемешайте ее для удаления остатков клеток и мусора, центрифугируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 минут при 600 G с обычным тормозом. Выбросьте надосадочную жидкость и заполните пробу до 10 миллилитров с помощью PBS.
Возьмите аликвоту для подсчета ячеек. Чтобы удалить тромбоциты, центрифугируйте их с помощью обычного тормоза и осторожно переверните трубку, чтобы сбросить надосадочную жидкость. Для выделения CD14-положительной моноцитов с помощью сортировки магнитно-активированных клеток ресуспендируют клеточную гранулу в буфере из микрогранул и иммуномагнитных гранул CD14.
Инкубируйте клеточную суспензию в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Чтобы удалить несвязанные шарики, добавьте от одного до двух миллилитров микрогранул буфера на один умножить на 10 до семи клеток, прежде чем центрифугировать суспензию при комнатной температуре в течение 10 минут при 600 G. Затем осторожно переверните пробирку, чтобы удалить надосадочную жидкость. Подготовьте колонку LS и поместите ее на магнит перед использованием.
Промойте его тремя миллилитрами микрогранул буфера и немедленно ресуспендируйте клеточную гранулу в 500 микролитрах микрогранул буфера на единицу от 10 до восьмой клетки. Добавьте клеточную суспензию на входное отверстие колонки LS и соберите отрицательную клеточную фракцию в коническую пробирку объемом 15 миллилитров ниже выходного отверстия колонки. Трижды промойте колонку тремя миллилитрами микрошарикового буфера.
После окончательной промывки снимите колонку с магнита и поместите ее на стерильную коническую трубку объемом 15 миллилитров. Пипеткой пять миллилитров микрошариков буферизуйте во входное отверстие колонки. Немедленно введите поршень шприца, заполненный целевыми клетками, во входное отверстие колонки и дозируйте клетки в колонке.
Затем центрифугируют CD14-отрицательную и CD14-положительную клеточные фракции и отбрасывают надосадочную жидкость. Для дифференцировки моноцитов в дендритные клетки, полученные из моноцитов человека, готовят клеточную суспензию, содержащую от 1,3 до 10 до шестой клетки на миллилитр, путем добавления соответствующего объема среды для дифференцировки к CD14-положительным клеткам. Ресуспендировать моноциты путем пипетирования с помощью пипетки Pasture.
После осаждения суспензии в 1,3 раза по 10 до шестой клетки на миллилитр в лунку 24-луночного планшета инкубировать в культуральном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Меняйте питательную среду и дополняйте ее свежими цитокинами каждые два-три дня. Чтобы собрать дифференцированные клетки, перенесите всю клеточную суспензию в стерильную коническую пробирку с помощью микропипетки и дважды промойте колбу с культурой PBS.
После центрифугирования конических пробирок при комнатной температуре в течение 10 минут при 180 G повторно суспендируйте гранулу в соответствующей среде или буфере для экспериментальной установки. В процессе дифференцировки моноцитов интерлейкин 4 и стимуляция колониестимулирующим фактором гранулоцитарных макрофагов изменяли фенотип клетки. Данные показали, что дендритные клетки, полученные из моноцитов человека, утратили экспрессию поверхностного маркера CD14, в основном экспрессируемого моноцитами, и приобрели значительную экспрессию CD1A.
маркер, экспрессируемый дендритными клетками человека. Дендритные клетки, полученные из моноцитов человека, также получают более высокую экспрессию MHC2 HLA-DR, антигенпрезентирующей молекулы, экспрессируемой дендритными клетками человека и другими антигенпрезентирующими клетками.