Treatment of the Monocyte-Derived Dendritic Cells (Mo-DCs) with Sialidase

Verzamel ongeveer 10 keer 10 tot de zesde van menselijke monocyten afgeleide dendritische cellen gedifferentieerd van de monocyten. Van de 10 putjes van de plaat met 24 putjes met 1,3 keer 10 tot de zesde cellen per putje, breng ze over naar een nieuwe steriele conische buis van 15 milliliter. Na het centrifugeren van de cellen bij 300G gedurende vijf tot zeven minuten bij kamertemperatuur, met behulp van de normale pauze, gooit u het supernatans weg om dode cellen en vuil te verwijderen.

Voeg 10 milliliter RPMI 1640-medium met 11,1 millimolaire glucose toe aan de buis. Na vier minuten centrifugeren bij kamertemperatuur op 300G, met de normale pauze, gooit u het supernatans weer weg. Voeg twee milliliter RPMI 1640-medium toe aan de celpellet en verdeel een milliliter van de celsuspensie in twee nieuwe steriele microbuisjes met het label nummer één en nummer twee.

Voeg aan microbuis één 500 milli-eenheden Sialidase van Clostridium perfringens toe. Incubeer beide buisjes gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius. Breng na incubatie de cellen van beide microbuisjes over in overeenkomstige nieuwe conische buisjes van 15 milliliter die zijn gelabeld als nummer één en nummer twee.

Voeg vervolgens ongeveer vier milliliter compleet RPMI 1640-medium met 10% FBS toe aan elke conische buis. Centrifugeer de buisjes gedurende vier minuten bij kamertemperatuur op 300G met behulp van de normale pauze en voeg vijf milliliter volledig RPMI 1640-medium toe aan de pellet. Plaat één milliliter cellen per putje.

De effectiviteit van de behandeling met Sailidase voor het verminderen van het siaalzuurgehalte op het oppervlak van van menselijke monocyten afgeleide dendritische cellen werd geëvalueerd door middel van flowcytometrie en confocale microscopie. Behandeling met sailidase verminderde de Maackia Amurensis-lectine en Sambucus nigra-lectinebinding aanzienlijk, terwijl de anutagglutinine-lectinekleuring toenam. De afname van Sambucus nigra-lectinekleuring na behandeling met Sailidase toonde een significant verminderde Sambucus nigra-lectinekleuring aan het celoppervlak.