Treatment of the Monocyte-Derived Dendritic Cells (Mo-DCs) with Sialidase

לאסוף בערך 10 פעמים 10 למונוציטים האנושיים השישיים נגזר תאים דנדריטים ממוינים מונוציטים. מ 10 בארות של צלחת 24 באר שיש 1.3 כפול 10 לתאים השישי לכל באר, להעביר אותם צינור חרוטי סטרילי חדש 15 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה של התאים ב-300G למשך חמש עד שבע דקות בטמפרטורת החדר, תוך שימוש בהפסקה הרגילה, יש להשליך את הסופרנאטנט כדי להסיר תאים מתים ופסולת.

הוסף 10 מיליליטר של RPMI 1640 בינוני המכיל גלוקוז 11.1 מילימולרי לצינור. לאחר צנטריפוגה בטמפרטורת החדר במשך ארבע דקות ב 300G, באמצעות הפסקה רגילה, להשליך את supernatant שוב. הוסף שני מיליליטר של מדיום RPMI 1640 לכדורית התא וחלק מיליליטר אחד של תרחיף התא לשני צינורות מיקרו סטריליים חדשים המסומנים כמספר אחד ומספר שתיים.

למיקרו צינור אחד, הוסף 500 מילי יחידות של Sialidase מ Clostridium perfringens. לדגור על שני הצינורות במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, העבירו את התאים משני צינורות המיקרו לצינורות חרוטיים חדשים של 15 מיליליטר המסומנים כמספר אחד ומספר שתיים.

לאחר מכן הוסף כארבעה מיליליטר של מדיום RPMI 1640 מלא המכיל 10% FBS לכל צינור חרוט. צנטריפוגו את הצינורות בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות ב 300G באמצעות הפסקה רגילה ולהוסיף חמישה מיליליטר של מדיום RPMI 1640 מלא לכדור. צלחת 1 מיליליטר תאים לכל באר.

יעילות הטיפול בסיילידאז להפחתת תכולת החומצה הסיאלית על פני השטח של תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים אנושיים הוערכה על ידי ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ קונפוקלי. הטיפול בסיילידאז הפחית משמעותית את קשירת לקטין מאקיה אמורנסיס וסמבוקוס ניגרה לקטין תוך הגברת צביעת לקטין בוטנים אגלוטינין. הירידה בצביעת Sambucus nigra lectin לאחר טיפול Sailidase הראתה ירידה משמעותית בכתמים של Sambucus nigra lectin על פני התא.