Treatment of the Monocyte-Derived Dendritic Cells (Mo-DCs) with Sialidase

単球から分化した第6のヒト単球由来樹状細胞を10倍程度集める。10の1.3倍の24ウェルプレートの10ウェルから、1ウェルあたり6番目の細胞まで、それらを新しい滅菌15ミリリットルのコニカルチューブに移します。細胞を室温で300Gで5〜7分間遠心分離した後、通常のブレークを使用して上清を廃棄し、死細胞と破片を除去します。

11.1ミリモルのグルコースを含む10ミリリットルのRPMI1640培地をチューブに加えます。室温で300Gで4分間遠心分離した後、通常のブレークを使用して、再び上清を廃棄します。2ミリリットルのRPMI 1640培地を細胞ペレットに加え、1ミリリットルの細胞懸濁液を、1番と2番とラベル付けされた2つの新しい滅菌マイクロチューブに分けます。

マイクロチューブ1に、クロストリジウム・パーフリンゲン由来のシアリダーゼを500ミリ単位添加します。両方のチューブを摂氏37度で60分間インキュベートします。インキュベーション後、両方のマイクロチューブから細胞を、1番と2番とラベル付けされた対応する新しい15ミリリットルのコニカルチューブに移します。

次に、10%FBSを含む約4ミリリットルの完全なRPMI 1640培地を各コニカルチューブに加えます。通常のブレークを使用して、チューブを室温で300Gで4分間遠心分離し、5ミリリットルの完全なRPMI 1640培地をペレットに加えます。ウェルごとに1ミリリットルの細胞をプレーティングします。

ヒト単球由来樹状細胞の表面のシアル酸含有量を低減するためのサイリダーゼ処理の有効性を、フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡法によって評価しました。サイリダーゼ処理により、Maackia AmurensisレクチンとSambucus nigraレクチンの結合が有意に減少し、ピーナッツ凝集素レクチン染色が増加しました。サイリダーゼ処理後の黒質蚪質レクチン染色の減少は、細胞表面での黒質苗質レクチン染色の減少を示しました。