Treatment of the Monocyte-Derived Dendritic Cells (Mo-DCs) with Sialidase

Coletar aproximadamente 10 vezes 10 até o sexto monócito humano derivado de células dendríticas diferenciadas dos monócitos. Dos 10 poços da placa de 24 poços com 1,3 vezes 10 até a sexta célula por poço, transfira-os para um novo tubo cônico estéril de 15 mililitros. Após centrifugar as células a 300G por cinco a sete minutos à temperatura ambiente, utilizando a pausa normal, descartar o sobrenadante para remover células mortas e detritos.

Adicione 10 mililitros de meio RPMI 1640 contendo glicose 11,1 milimolares ao tubo. Após centrifugar à temperatura ambiente por quatro minutos a 300G, utilizando a pausa normal, descarte novamente o sobrenadante. Adicione dois mililitros de meio RPMI 1640 ao pellet de célula e divida um mililitro da suspensão celular em dois novos microtubos estéreis rotulados como número um e número dois.

Ao micro tubo um, adicione 500 mili unidades de Sialidase de Clostridium perfringens. Incubar ambos os tubos por 60 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, transfira as células de ambos os microtubos para os tubos cônicos novos correspondentes de 15 mililitros rotulados como número um e número dois.

Em seguida, adicione aproximadamente quatro mililitros de meio RPMI 1640 completo contendo 10%FBS a cada tubo cônico. Centrifugar os tubos à temperatura ambiente por quatro minutos a 300G usando a quebra normal e adicionar cinco mililitros de meio RPMI 1640 completo ao pellet. Placa de um mililitro de células por poço.

A eficácia do tratamento com Sailidase na redução do conteúdo de ácido siálico na superfície de células dendríticas derivadas de monócitos humanos foi avaliada por citometria de fluxo e microscopia confocal. O tratamento com sailidase diminuiu significativamente a ligação da lectina Maackia Amurensis e da lectina de Sambucus nigra, enquanto aumentou a coloração de lectina de aglutinina de amendoim. A diminuição na coloração de lectina de Sambucus nigra após o tratamento com Sailidase mostrou uma redução significativa da coloração de lectina de Sambucus nigra na superfície da célula.