Para começar, dissolva o pó vermelho do Nilo em acetona a três miligramas por mililitro de concentração. Incubar a solução durante 15 minutos à temperatura ambiente com mistura periódica. Filtrar a solução utilizando um filtro de 0,22 micrómetros uma ou duas vezes, dependendo da quantidade de precipitado restante na solução.
Em seguida, prepare a solução de trabalho diluindo a solução de estoque em uma proporção de um para 500 em DPBS. Adicionar 200 microlitros da solução de trabalho às células de EPR fixadas em paraformaldeído e incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente num agitador que proteja da luz. Após a incubação, lave as amostras duas vezes com DPBS, adicione 200 microlitros de DPBS e armazene-as a quatro graus Celsius.
Para a coloração de BODIPY, preparar uma concentração de estoque de 3,8 milimolares dissolvendo BODIPY em DMSO anidro. Em seguida, prepare a solução de trabalho diluindo a solução estoque em uma proporção de um para 300 em DPBS. Adicionar 200 microlitros da solução de trabalho de BODIPY às células de EPR fixadas em paraformaldeído e incubar durante a noite num balancim à temperatura ambiente.
No dia seguinte, lave as células duas vezes com DPBS e adicione 200 microlitros de DPBS antes de armazená-las a quatro graus Celsius. Para imunomarcação de APOE, prepare uma solução tampão combinando DPBS com 1% BSA, 0,5%Tween 20 e 0,5% Triton X-100. Bloquear e permeabilizar as células de EPR fixadas em paraformaldeído em 200 microlitros de solução tampão por uma hora.
Após a incubação, adicionar o anticorpo primário APPLE diluído de um a 100 na solução tampão e incubar durante a noite à temperatura ambiente. No dia seguinte, lave as amostras duas vezes com DPBS. Em seguida, adicione 200 microlitros de solução de anticorpos secundários diluídos de um a 1000 por uma hora à temperatura ambiente.
Após a incubação, lave as células duas vezes com DPBS e adicione 200 microlitros de DPBS antes de armazená-las a quatro graus Celsius.